| Project/Area Number |
23K09372
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57060:Surgical dentistry-related
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
工藤 景子 徳島大学, 病院, 講師 (70380029)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮本 洋二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 特命教授 (20200214)
福田 直志 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (10804156)
秋田 和也 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (70876028)
工藤 隆治 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (10263865)
高丸 菜都美 徳島大学, 病院, 講師 (40513031)
栗尾 奈愛 徳島大学, 病院, 講師 (80622141)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 炭酸アパタイト / 魚うろこコラーゲン / 顎骨再建 / Guided Bone Regeneration |
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| Outline of Research at the Start |
申請者らは、九州大学との共同研究で、生体骨の主成分である炭酸アパタイトの人工合成に世界で初めて成功した。開発された炭酸アパタイトは優れた骨伝導能と骨置換能を有する。しかし、顆粒状であるため、外側性の骨欠損欠損の再建には不向きだった。そのため、魚うろこコラーゲンとの複合体を作製し、操作性にも優れた材料の開発を進めてきた。
本研究では、この作製技術を発展させ、自在に整形できるシート状の炭酸アパタイト／魚うろこコラーゲン複合体の開発を目指す。開発複合体を筒状に丸めて骨欠損部へ移植すれば、単一の材料でGuided Bone Regeneraion（GBR法；骨誘導再生用法）が可能になると考えている。
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）炭酸基含有量と異なる炭酸アパタイト顆粒の作製：硫酸カルシウムを出発原料とし、炭酸化、リン酸化を経て作製した。本実験では、リン酸源は0.4mol/Lのリン酸水素ナトリウムに固定し、炭酸源を3種類の炭酸水素ナトリウム（0.2、0.4、0.8 mol/L）と変えることで異なる炭酸基含有量を有する試料を調製した。炭酸基含有量はX線回折、フーリエ赤外分光光度分析、元素分析（CHN分析）で測定し、評価した。1.9%、6.1%、10.9%の3種類の炭酸含有量の炭酸アパタイト顆粒が作製できた。尚、作製した顆粒は、ふるいわけと蒸留水による洗浄・乾燥を実施し、300-600μmのサイズのものを以下の実験に用いた。
２）炭酸アパタイト顆粒と魚うろこコラーゲンとの複合体を作製：１）で作製した3種類の炭酸基含有量の炭酸アパタイト顆粒と魚うろこコラーゲン（CellcampusFD08G (Taki Chemical, Hyogo, Japan)）,の複合体を作製し、直径9mm、厚さ1mmの円柱状とした。魚うろこコラーゲンの濃度は、過去の研究結果より3%とし、魚うろこコラーゲンに対する炭酸アパタイト顆粒量は40w%とした。
３）in vitroでの検証：3種類の試料を24穴培養プレートに留置し、以下の実験を行った。１）細胞接着性の評価：近交系ラット大腿骨より初代培養した骨髄幹細胞混濁液（1x10^4個/50μL）を滴下⇒24時間培養後に、MTT assayとヘキスト33342染色で細胞接着性を評価した。炭酸基量の異なる3種類の試料において、細胞接着性に明らかな有意差はなかった。２）化誘導能（骨形性能）の評価：１）と同様に近交系ラット骨髄幹細胞混濁液を播種し、経時的に細胞増殖とアルカリホスファターゼ、タイプＩコラーゲン、オステオカルシンの遺伝子発現をリアルタイムPCRにて測定し、骨形性能として評価した。炭酸基量の異なる3種類の試料において、炭酸基量が多い試料がタイプＩコラーゲンの発現量が多い傾向があったが、明らかな有意差はなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
作製した炭酸アパタイト（3種類の炭酸含有量）と魚うろこコラーゲン複合体を用いて、in vitroとin vivoの検証まで実施予定だったが、2024年度は、初年度に引き続いての試料作製の他、in vitroまで実施したが、有意差が得られず、複数回検証を行ったため、in vitro検証の途中までしか進行していない。そのため、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2025年度は作製した炭酸アパタイト（3種類の炭酸含有量）と魚うろこコラーゲン複合体を用いて、in vitro（2024年度の続き）とin vivoの検証を行う予定である。
１．in vitroでの検証（2024年度の続き）：破骨細胞による吸収性の評価：近交系ラット骨髄幹細胞をM-CSFとRANKLの存在下で破骨細胞へと分化誘導する。この細胞を複合体試料上で培養し、Pit formation assayを用いて吸収性を評価する。
２．in vivoでの検証：3種類の試料（1.9%、6.1%、10.9%の3種類の炭酸含有量の炭酸アパタイト顆粒）をWister系ラット（雄性、12週齢）の頭蓋骨にトレフィンバーで作製した直径9mmの骨欠損に移植する（ラットの場合、クリティカルサイズは9mm）。移植4、8、12、24週後に試料を摘出し、組織標本（HE染色、VG染色）やμCTを用いて、試料の吸収量、新生骨量を測定することで骨伝導能、骨置換能の検証を行う。
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