| Project/Area Number |
23K09441
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57070:Developmental dentistry-related
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
窪田 直子 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (40569810)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 正宏 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, ゲノム医療研究部, リサーチアソシエイト (30287099)
稲田 絵美 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (30448568)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
齊藤 一誠 朝日大学, 歯学部, 教授 (90404540)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | ヒト乳歯歯髄細胞 / アルカリホスファターゼ |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、Oct-3/4 promoter-EGFP（緑蛍光タンパク遺伝子をコード）発現ユニット搭載の組換えHDDPCを樹立する。当該細胞へOCT-3/4遺伝子を導入し、OCT-3/4を強制発現することにより、幹細胞様細胞としてのOCT-3/4(+)/EGFP(+)HDDPCを取得する。この細胞の特性解析（OCT-3/4以外の幹細胞特異的遺伝子発現解析、多分化能性の有無、iPS細胞への誘導のされやすさ、など）を通じ、当該細胞が上皮細胞との共培養による器官培養系で歯再生に優先的に貢献できるかどうかを検討することを目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、「OCT3/4陽性乳歯歯髄細胞（OCT3/4(+)HDDPC）は幹細胞様特性を有する」と予想し、それが歯再生分野への有効なリソースになり得ると考え、①OCT3/4(+)HDDPCの効率的な取得に向けた検討、②当該細胞の特性解析、③当該細胞の歯系細胞再生への可能性、などを明らかにする。
HDDPCをOCT3/4(+)HDDPCに強制的に誘導させるため、OCT3/4遺伝子発現ユニットを搭載したpiggyBac（PB）系プラスミド（pT-OCT3/4）、EGFP蛍光遺伝子発現ユニットを搭載したPBプラスミド（pT-EGFP）、薬剤耐性遺伝子（puro）発現ユニットを搭載したPBプラスミド（pT-puro）とPB transposase発現プラスミド（pTrans）をHDDPCに共遺伝子導入した。残念ながら、得られた薬剤耐性cloneはOCT3/4を発現せず、また、アルカリホスファターゼ（ALP）陰性であった。一方、遺伝子の一過的発現に基づく山中因子の繰り返し遺伝子導入という方法も採用したが、ALP陽性細胞取得には失敗した。
そこで、新たな方法として、pEBM をベースにしたepisomal vector（浮遊型ベクター）導入による OCT3/4持続発現HDDPCの取得を考えた。まず、pEBM-OCT3/4-2AE（OCT3/4、EGFPを同時発現し、かつ、neomycin耐性遺伝子搭載（neo）を搭載）を構築した。先行研究として、pEBM-OCT3/4-2AEをHEK293細胞に遺伝子導入し、その後、G418を含む培地で細胞を培養した結果、生存細胞株はEGFP蛍光を発現した。このことは、当該細胞内でOCT3/4を発現していることを意味する。同結果を受け、現在、HDDPCへpEBM-OCT3/4-2AEを遺伝子導入し、EGFP発現細胞株の単離を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
OCT3/4は他の幹細胞マーカー発現を誘導する「マスター遺伝子」と目されるため、HDDPCなどの分化細胞にOCT3/4を強制発現させることで、HDDPCは幹細胞様細胞へ誘導されると期待される。その結果、幹細胞様細胞はOCT3/4以外にもALP、SOX2などの幹細胞マーカーも発現するようになると考えられる。
HDDPCを幹細胞様細胞に転換させるため、pEBM-OCT3/4-2AEをHDDPCに遺伝子導入した。遺伝子導入後、3～4日目に培地をG418含有に替え、遺伝子導入細胞のみを選別する。通常であれば、遺伝子導入後7～10日目にEGFP蛍光を発するcolonyが出てくる筈である。これをチップで拾い、G418含有培地で拡大させた後、OCT3/4持続的発現による細胞挙動（細胞増殖速度、細胞形態など）の変化を調べる。また、RT-PCR法で幹細胞特異的マーカー発現を調べる。現在まで4回の遺伝子導入実験を行った。1回目は遺伝子導入効率が低く、細胞選別後に細胞が増殖しなかった。しかし、その後、プラスミドの量や細胞選別開始時期等を改善することで遺伝子導入効率や細胞生存率が向上した。現在、生存細胞を拡大しており、今後、各種解析を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
HDDPCを幹細胞様細胞に転換させため、pEBM-OCT3/4-2AEをHDDPCに遺伝子導入し、薬剤選別の後、OCT3/4(+)HDDPC株を得る。同細胞が幹細胞様細胞への変換を示すかどうか、①ALP活性検索への組織化学的染色、②RT-PCR法による幹細胞特異的マーカー発現の検索（OCT3/4強制発現によりSox2などの内在性マーカーの発現が誘導されると期待）、③多分化能性（神経細胞、骨芽細胞、脂肪細胞などへ細胞分化する能力）の検索（OCT-3/4(+)HDDPCは体性幹細胞のような細胞と考えられるので、培地に分化誘導剤を加えた場合、各種分化細胞が得られる可能性がある）、などの処置を行う。
上記の細胞特性解析の結果、OCT3/4遺伝子の強制導入によって得られた細胞は、幹細胞的特性を示すと判断されれば、それが歯系細胞の再生に使えるか、その可能性を調べる。具体的には、妊娠中期マウス胎仔（E15.5）歯槽堤由来上皮細胞との共培養（器官培養）によるOCT-3/4(+)HDDPCの歯形成への関与を検討する。実験群はOCT-3/4(+)HDDPCとマウス胎仔歯槽堤部由来上皮細胞を混和したもの、対照群は親株HDDPCと歯槽堤部由来細胞を混和したものとし、5×108細胞/mLの高密度懸濁液を作製する。これを細胞外基質タンパク質が豊富なmatrigel中に注入し、ドロップを作製する。35-mm tissue culture dishに培地を3mLずつ加え、3μm孔径のIsopore Membrane Filter（Merck Millipore）を培地の上に浮かべ、前述の細胞含有ドロップをフィルター上に載せ、器官培養する。約２週間後、ドロップ内の歯系細胞や歯牙様構造（歯の再生）の有無を組織学的に、また、分子生物学的に検証する。
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