ヒ素代謝細菌を指標とした環境中の薬剤耐性細菌群の評価手法の開発

• Project/Area Number: 23K11465
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 64010:Environmental load and risk assessment-related
• Research Institution: National Institute for Environmental Studies
• Principal Investigator: 山村 茂樹 国立研究開発法人国立環境研究所, 地域環境保全領域, 室長 (90414391)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 天知 誠吾 千葉大学, 大学院園芸学研究院, 教授 (80323393)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ヒ酸還元細菌 / 亜ヒ酸酸化細菌 / 薬剤耐性菌 / 共耐性

Outline of Research at the Start

本研究では、好気性ヒ酸還元細菌と亜ヒ酸酸化細菌の活性等を指標として、環境サンプル中の薬剤耐性菌群の評価を試みる。また、培養法と分子生物学的手法を組み合わせることで、詳細な調査を行う。具体的には、抗生物質を添加した模擬汚染土壌を液体培地を用いて培養し、ヒ酸還元/亜ヒ酸酸化活性を調べることで、サンプル中の薬剤耐性菌の優占度や耐性遺伝子拡散の可能性を評価する。優占細菌株の分離や遺伝子解析など詳細な調査を行い、実際に薬剤耐性細菌の挙動が把握できていることを検証する。最終的には、環境サンプルを用いた実証試験を行い、実際の調査に適用するための標準プロトコルを作成する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、環境サンプルをヒ酸(As(V))あるいは亜ヒ酸(As(III))を含む液体培地を用いて培養し、そのAs(V)還元あるいはAs(III)酸化活性を調べることで、サンプル中の薬剤耐性菌の優占度等を包括的に評価できると考えている。
そこでまず、これらの評価に最適なAs(V)還元・As(III)酸化活性測定の条件を検討を行った。つくば市内で採取した畑地土壌を組成の異なる複数種の培養液に接種し、所定濃度のAs(V)あるいはAs(III)を添加して恒温室で振盪培養を行い、培養液中のAs(V)及びAs(III)濃度をイオンクロマトグラフィーで経時的に測定した。まずハンドリングが容易な複合培地(LB培地及びR2A培地)を用いて活性測定を試みたところ、培養が進むにつれて培地成分の代謝物とみられる複数のピークがAs(V)及びAs(III)のピークと重なる形で出現し、正確な定量が困難であった。そこで、炭素源としてグルコースあるいは乳酸ナトリウムを含む無機塩培地を用いて実験を行ったところ、実験開始直後からAs(V)還元及びAs(III)酸化活性が見られた。
また、予備的にクロラムフェニコールを添加して同様の実験を行った結果、活性の変化を検出することに成功した。一方で、対象として行った炭素源のみを添加して行った実験では、活性が発現するまでに2週間以上の期間を要した。以上の結果から、As(V)還元・As(III)酸化活性の安定した測定には、無機塩培地が最適であることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

As(V)還元・As(III)酸化活性の最適条件は確立できたが、家庭の事情により実験をストップせざるを得ない期間があり、年度内に予定した一部の実験を実施できなかったため、全体的な進捗がやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

昨年度確立したAs(V)還元・As(III)酸化活性の評価系を用いて、抗生物質がそれぞれの活性に与える影響を評価する。抗生物質を添加した模擬汚染土壌を作成し、一定期間ごとにサンプリングを行う。それぞれのサンプルに対して、抗生物質存在下での活性試験を実施し、コントロール系(抗生物質非添加)と比べて活性が上昇するかを検証する。さらに、次世代シークエンサーを用いた16S rRNA遺伝子のアンプリコン解析により細菌叢をモニターし、サンプル内で優占する耐性細菌群を把握する。