| Project/Area Number |
23K11859
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 90120:Biomaterials-related
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
上野 富雄 川崎医科大学, 医学部, 教授 (70284255)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | ヒト小腸粘膜下組織 / 脱細胞化 / 小腸粘膜下組織 / 細胞外基質 / 成長因子 |
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| Outline of Research at the Start |
標準的外科治療により摘出した小腸を既報にある物理的手法、化学的手法、生物学的手法を組み合わせ、成長因子を十分に含んだ至適なヒト小腸の脱細胞化組織を得る条件を探る。同種移植を前提としており、完全な脱細胞化ではなく、至適条件を明らかにする。
ブタ小腸から脱細胞化したブタSISの作製法は既報で３報あり、①Badylakらの方法、②Abrahamらの方法、③Luoらの方法で、ヒト小腸から脱細胞化ヒトSISを作成する。
脱細胞化の確認は、（1）HE染色と走査電子顕微鏡検査、（2）DNA抽出及び残存DNA量の評価、（3）たんぱく抽出及びSISの成長因子含有量の測定、（4）細胞増殖・生存の評価により行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト小腸に対して以下の方法で脱細胞化を行っている。また脱細胞化の程度を（1）HE染色と走査電子顕微鏡検査、（2）DNA抽出及び残存DNA量の測定を行い、評価している。
①Badylakらの方法：採取した小腸を-80℃で凍結し，解凍して滅菌精製水で5分間洗浄する。 次に、粘膜および漿膜筋層を物理的剥離し生SISを作製する。そのSISを0.1％過酢酸（PAA）/ 4％エタノール溶液（湿重量10 gあたり100 ml）で2時間連続攪拌（250 rpm）する。最後に緩衝生理食塩水 (PBS)で15分洗浄を2回行い、 脱イオン水で15分洗浄を2 回行う。
②Abrahamらの方法：採取した小腸を物理的剥離して粘膜および漿膜筋層を除去し生SISを作製する。そのSISをpH12の10mM水酸化ナトリウム(NaOH)/100mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液で16時間インキュベートする。 次に、pH1の1M塩化ナトリウム(NaCl)/1M塩酸(HCL)で8時間インキュベーションを行う。さらにpH7.4の1M NaCl/10mM PBSで16時間インキュベーションし、次いで10mM PBSで2時間インキュベーションする。最後に、組織を滅菌精製水で2時間すすぐ。
③Luoらの方法：採取した小腸を物理的剥離して粘膜および漿膜筋層を除去し、生SISを作製する。次にメタノール/クロロホルム (1:1、V/V) を含む溶液に 12 時間浸し、脱イオン水ですすぐ。次に0.05%トリプシン/0.05% EDTA中で37℃12時間インキュベートし、生理食塩水ですすぐ。続いて，0.9%塩化ナトリウム中の0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で4時間連続攪拌した後、生理食塩水で十分にすすいで洗剤を除去する。最後に 0.1% ペルオキシ酢酸/ 20% エタノールに 30 分間浸し、生理食塩水ですすぐ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実験計画は概ね順調に進展しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定通り行う。具体的には同様の実験を繰り返し、データを蓄積し、どの方法がヒト小腸における最適な脱細胞化方法なのかを探る。
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