| Project/Area Number |
23K13947
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 39030:Horticultural science-related
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
間瀬 誠子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 果樹茶業研究部門, 上級研究員 (10355365)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | 体細胞突然変異 / 放射線突然変異 / キメラ / カンキツ / NGS解析 / 放射線育種 / 次世代シーケンサー / 永年性作物 / 枝変わり / 放射線 / 次世代シーケンス |
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| Outline of Research at the Start |
永年性植物の体細胞突然変異はキメラ状に発生することが多い。本研究では、刺が長いカンキツ品種「せとか」の原品種と複数の短刺化突然変異体について、次世代シーケンス解析により遺伝子配列を比較することにより、変異体のキメラ性の判別と、複数の変異体に共通する遺伝子変異領域のスクリーニングを行う。さらに、検出された変異配列の定量PCRと短刺化程度の関連、既知の短刺関連遺伝子との関係の調査により、短刺化変異関連領域の特定する手法の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、永年性作物の体細胞突然変異体（枝変わり）において発生することが多い、原品種と突然変異細胞が混在するキメラ状変異の有無を迅速に評価することを目的としている。
放射線育種場において、トゲが長いカンキツ品種「せとか」の枝にガンマ線を急照射して獲得した、短刺化変異体11個体、短刺化変異体から分離したトゲが長い系統1個体、原品種（無照射）2個体から令和5年度に得たショートリード配列を、クレメンティンの半数体ゲノム配列（Cclementina_182）にマッピングした。各系統の配列について、bcftoolsを用いて各変異系統特異的な多型および変異系統間で共通する多型を検出した。Depth、クオリティスコア等により変異座を絞り込み、IGV (Integrative Genomics Viewer) を用いてSNPsおよびIndel座のアレル比の変化を調査した。キメラ状変異によるアレル頻度の変動の情報を失わないために絞り込み条件を緩く設定したところ、各系統に特異的なSNPsが8万カ所前後検出されたため、検出数がSNPsより少なかったIndelを優先的に解析した。
カンキツ近縁種カラタチのトゲの長さを制御する遺伝子との関連を調べるため、長刺形質のQTLが座上する連鎖群3に相当するクレメンティンのscafford3にマッピングされた「せとか」各系統の配列を解析した。その結果、変異体1系統において、原品種ではヘテロ型であったSNPまたはIndel座でヘテロ性が喪失している領域（十数bp～数十kb）が複数検出された。領域中のリファレンス配列には12種のmRNA配列がマッピングされていた。「せとか」原品種に存在するクレメンティンの相同配列が全く検出されなかった領域が検出されたことから、突然変異細胞のみから成る系統と推定され、ゲノムの大規模な欠失または構造変異が生じている可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
変異体にSNPsが想定以上に多数検出されたため、ヘテロ型バリアントのアレルの頻度の不均衡の原因が、リード取得時のエラーとキメラ状変異のどちらによるものかを推定するため、連続する複数の座におけるアレル頻度の調査を行っている。
カラタチのトゲ長の制御遺伝子との関連は不明ながら、同一染色体上に大規模な欠失が生じた可能性がある変異体が見つかったことから、大規模な欠失またはゲノム構造の変異の解析が可能なロングリード配列解析が必要と考え、ショートリード情報の追加取得する計画を変更し、変異系統の数を絞ってロングリード配列の取得を行うことにした。令和6年度中に委託解析が完了する予定だったが、委託先の技術的トラブルによりデータ取得が遅延している。
複数の系統に共通して変異が生じたゲノム領域の特定には至っていないが、特定し次第変異領域中の遺伝子の発現解析を行うことができるように、各系統について、生育期間中の異なる時期（5～8月）に伸長した枝先と葉を採取し、RNAの抽出方法について検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題実施期間を1年延長し、ショートリード配列に加え、ロングリード配列情報を用いてキメラ状変異の識別と複数の変異系統間で共通する配列の変異の特定を進め、共通の変異が検出された領域を短刺化変異関連領域として絞り込みを行う。
短刺系統に共通する変異配列について、リアルタイムPCRによる変異体と原品種の配列の増幅量との比較を行い、リシーケンス解析で取得したリードの割合との相関を調査する。さらに、トゲ形質の表現型と、短刺化変異関連領域に存在する遺伝子の発現量の違いを解析する。
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