Characterization of coccolith-associated and alkenone synthesis genes through development of genome editing in haptophytes

• Project/Area Number: 23K14001
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 40030:Aquatic bioproduction science-related
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 米田 広平 筑波大学, 生命環境系, 特任助教 (10829104)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2026: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: ハプト藻 / 円石 / アルケノン / ゲノム編集

Outline of Research at the Start

ハプト藻が合成する円石やアルケノンは，カーボンニュートラルな素材として有用だが，形質転換の難しさから，その形成メカニズムや合成に関わる酵素は，実験的に明らかになっていない．本研究では，円石藻Pleurochrysis carterae，及びアルケノン産生藻Tisochrysis luteaを対象に，CRISPR/Cas9ゲノム編集系を構築し，円石形成に関わるCalcium binding proteinや，アルケノン合成に関わるPolyketide synthaseの機能解析を行う．また，機能同定した遺伝子の発現量改変により，円石やアルケノン合成量を強化した育種株の作製を試みる．

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、ハプト藻のうち、円石と呼ばれる炭酸カルシウムの殻を形成するPleurochrysis carteraeと、アルケノンと呼ばれる長鎖アルキルケトンを合成する Tisochrysis luteaを対象にゲノム編集系を構築すること、円石形成やアルケノン代謝に関わる遺伝子の機能解析を行う。初年度は、両ハプト藻のゲノム編集系構築に向けたCRISPR/Cas9系システムの改良を行った。また、アルケノン代謝における不飽和化酵素(アルケノンデサチュラーゼ)の機能解析を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ゲノム編集系構築では、Tisochrysis luteaに用いるCRISPR/Cas9系発現ベクターの改良を行い、フコキサンチン生合成に関わる遺伝子であるVDL2に対するRGR系でのsingle guide RNA発現ベクターを構築した。Pleurochrysis carteraeにおけるゲノム編集系では、組換えCas9タンパク質を直接導入する計画が進行中であり、大腸菌での組換えタンパク質発現ベクターが完成した。アルケノン代謝研究では、円石藻Emiliania huxleyiが持つアルケノン不飽和化酵素の候補遺伝子をTisochrysis luteaへと異種発現させた株の構築を行い、機能解析を行った。結果、当該遺伝子が、C37メチルアルケノン不飽和化酵素であることが示された。

Strategy for Future Research Activity

ゲノム編集系構築に関しては、改良を加えつつ、初年度に構築した系を順次適用していく。また、各種オミクス解析などを用いて、アルケノン代謝や円石形成に関わる遺伝子の洗い出しを行い、ゲノム編集系によって、機能解析を進めていく。