| Project/Area Number |
23K14132
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
楊 其駿 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (80792647)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | Claspin / stress / Heat shock / elf2 / Chk1 |
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| Outline of Research at the Start |
Claspinは複製ストレスチェックポイントにおいて、エフェクターキナーゼChk1にシグナルの仲介分子として機能する。研究代表者は、Claspinが血清飢餓からの増殖再開に必須の役割を果たすことを見出した。この発見に基づき、熱、浸透圧、酸化、低酸素など種々の生体ストレスに対する応答を調べた結果、これらの種々のストレスに応答してClaspinに依存してChk1が活性化されることを見出した。本研究では、これら種々のストレス応答におけるClaspinの上流、下流因子を同定し、その詳細な細胞応答経路を解明するとともに、複製ストレス経路と他のストレス経路との機能的クロストークの実体を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Claspinは、DNA複製におけるフォーク進行と開始を促進する重要な複製因子として知られています。近年、私たちはClaspinの新たな役割を発見しました。それは、酸化ストレス、浸透圧ストレス、温度変化、細菌感染、低酸素、高グルコースなど、様々な生物学的ストレスに対する細胞応答に関与するということです。これらのストレスは、Chk1と呼ばれるキナーゼをClaspin依存的に活性化します。
私たちは、4つのeIF2aキナーゼ（PERK、GCN2、PKR、HRI）を欠損させたMEF細胞株を用いて、Claspin-Chk1活性化メカニズムをさらに調べました。その結果、GCN2とHRIの発現がClaspin-Chk1活性化に必須であること、eIF2aキナーゼがClaspin-Chk1の活性化状態の維持に必要であることが明らかになりました。これらの結果から、eIF2aキナーゼは、Claspin-Chk1活性化と細胞の熱ストレス応答に重要な役割を果たしていると考えられます。
私たちは、高温処理でClaspinのC末端に存在する5つのリン酸化サイトがリン酸化されることを質量分析によって確認しました。さらに、生化学的解析とキナーゼ阻害剤を用いて、これらのリン酸化サイトがGCN2とHRIによってリン酸化されることを検証しました。これらの結果から、ClaspinとeIF2aキナーゼの相互作用は、細胞の熱ストレス応答に重要な役割を果たしていると考えられます。さらに、2つのリン酸化サイト変異体細胞株を作製しました。この変異体細胞株は、今後の熱ストレスやその他の生物学的ストレスに対する細胞応答にどのように影響を与えるかを検証できます。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
熱ストレスは、eIF2αキナーゼのGCN2とHRIの発現によってChk1活性化が回復され、その活性化にはeIF2αキナーゼが必要であることが発見されました。eIF2αキナーゼは、Claspin-Chk1またはその活性化状態の維持に必要であることが示唆されました。さらに、ClaspinのC端の5つのリン酸化サイトがリン酸化されました。この5つのリン酸化サイトはGCN2とHRIによりリン酸化されました。ClaspinとeIF2αキナーゼの相互作用は、高温に対する細胞応答の役割が重要だと考えています。熱ストレスが誘導するClaspinのリン酸化を指標に、そのリン酸化部位を同定しました。高温により、ClaspinのC末端の5つのリン酸化部位がリン酸化されることが確認されました。これら5つのリン酸化部位のリン酸化は、生物情報学的手法により、GCN2とHRIが可能性のあるリン酸化酵素として予測されました。さらに、純化されたタンパク質を用いて、GCN2とHRIがClaspinのC末端の5つのリン酸化部位をリン酸化できることを確認しました。また、Claspinの5つのリン酸化部位を持つ変異体を安定に発現する細胞株を構築し、この細胞株を用いて、ClaspinのC末端の5つのリン酸化部位がChk1の活性化を促進できることが確認されました。ClaspinとeIF2αキナーゼの相互作用に関する高温に対する細胞応答の役割についての研究は順調に進行しています。
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| Strategy for Future Research Activity |
Claspinの5つのリン酸化部位を持つ変異体を安定に発現させる細胞株を用いて、関連キナーゼを同定し、それらの機能的意義を解析します。Claspinが高温に対する細胞応答のメカニズムを解析します。今後、私たちは作製した5つのリン酸化サイト変異体細胞株を利用して、その変異体が熱ストレスやその他の生物学的ストレスに対する細胞応答にどのように影響を与えるかを検証する予定です。
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