| Project/Area Number |
23K14137
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
林 順司 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 講師 (20802101)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | 酵素工学 / 酵素 / 超好熱菌 / 構造生物学 / 脱水素酵素 |
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| Outline of Research at the Start |
先行研究において超好熱菌の色素依存性脱水素酵素 (Dye-DH)のバイオセンサー素子としての有用性を立証したが、見出した酵素は少ない。バイオセンサーの普及には食品・医療分野で求められる多様な基質を測定できる必要があり、新たなDye-DHの探索が不可欠である。本研究では色素依存性D-乳酸脱水素酵素 (DLDH)に着目した。DLDHの触媒機構・基質認識機構を構造生物学的に解明し、機能改変に繋がる情報を獲得することで、D-乳酸以外のD-α-ヒドロキシ酸類を測定できる新規人工酵素の創製を本研究の目標としている。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、超好熱菌の色素依存性D-乳酸脱水素酵素 (DLDH) の構造情報に基づき、DLDHを基盤とする新規人工酵素の創製を目的としている。D-乳酸をはじめとしたD-ヒドロキシ酪酸類は生体内あるいは微生物代謝産物として広く分布している。これらD-ヒドロキシ酪酸類を測定可能な酵素を開発することで、臨床・食品用バイオセンサー素子の開発に寄与する。
令和6年度において、超好熱菌Aeropyrum pernixのDLDH（ApeDLDH）の基質/補酵素複合体のX線結晶構造解析に着手し、数種の条件検討を行い結晶の作製に成功した。この結晶を用いて高エネルギー加速器研究機構にてX線回折実験を行い、2.6Åの分解能が得られた。構造精密化により、結晶に基質および補酵素が結合していることが明らかとなり、ApeDLDHの基質/補酵素複合体の立体構造の解明に成功した。また、触媒残基の特定にも成功し、触媒機構の解明にも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和6年度において、ApeDLDHの基質/補酵素複合体の構造解析に成功した。これにより、DLDHの触媒残基の特定され、触媒機構が明らかとなった。以上の理由から、本研究はおおむね順調に進展していると判断する。現時点の実績をまとめ論文を執筆中である。最終年度（令和7年度）では、DLDHの基質認識機構を解明し、基質特異性を改変した人工酵素を作製することを目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和6年度までにApeDLDHの基質/補酵素複合体の立体構造を取得し、触媒機構の解明に成功した。しかし、基質認識機構は依然として解明できていない。ApeDLDHはD-乳酸およびD-2-ヒドロキシ酪酸以外のヒドロキシ酪酸は基質としない特徴がある。令和7年度では、この厳密な基質特異性を解明し、基質特異性を改変するための基質認識残基の特定が今後の課題である。基質/補酵素複合体の立体構造は解析できているため、今後、基質認識の鍵残基の特定を進める。具体的には、基質認識に寄与すると予想される残基を部位特異的に変異させ、D-2-ヒドロキシ酪酸類に対する活性を調査する。複数の残基が基質認識に寄与する可能性も有るため、候補残基を徹底的に調査する。最終的に、ApeDLDHの基質特異性を改変した人工酵素を作製することを目指す。
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