| Project/Area Number |
23K14149
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
小松谷 啓介 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術支援センター, 研究員 (30795620)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | コンドロイチン硫酸 / 神経細胞接着分子 / GPIアンカー / 糖脂質 / 糖鎖 / GPIアンカータンパク質 / 小脳 |
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| Outline of Research at the Start |
神経細胞接着分子Contactin-6/NB-3がどのような分子メカニズムにより小脳のシナプス形成に関与しているかを明らかにする。
NB-3を含むContactin familyは細胞外のリガンドと結合し細胞内にシグナルを伝達する機能を持つ。本研究では、NB-3に対するモノクローナル抗体を用いたクロスリンク刺激により、NB-3が関与するシグナル伝達系を明らかにすると同時に、表面プラズモン共鳴解析によりNB-3の新規リガンドの探索も行うことで小脳のシナプス形成に関わる分子メカニズムを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、神経細胞接着分子Contactin-6/NB-3が小脳シナプス形成にどのように関与するかを明らかにすることである。NB-3は平行線維とプルキンエ細胞間のシナプス形成に必須で、NB-3の遺伝子変異は自閉症スペクトラム障害や統合失調症を引き起こす。しかし、その分子メカニズムは未だに明らかになっていない。本研究では、NB-3が細胞外リガンドと結合することで、シナプス形成に関わるシグナルを伝達すると考え、新規リガンドの探索とシナプス形成に関わるシグナル分子の探索を行った。
小脳顆粒細胞の初代培養にNB-3モノクローナル抗体を用いたcross-link刺激実験により、シグナル伝達因子(PDK1、Akt、mTOR、S6K)を同定した。さらに、先行研究で見出したNB-3と強く結合するコンドロイチン硫酸E(CS-E)により、小脳顆粒細胞を刺激するとcross-link刺激実験と同様のシグナル伝達因子のリン酸化が検出された。この結果から、CS-EはNB-3のリガンドとして機能し、細胞内にシグナルを伝達することが示唆された。
NB-3はGPIアンカータンパク質のため、細胞内にシグナルを伝達する際に結合パートナーが必要である。NB-3の結合パートナーの探索も行った。そこで着目したタンパク質がContactin-associated protein (Caspr) familyであり、Caspr1、Caspr2、Caspr3、Caspr4、Caspr5にFc tagを融合しHek293Tに発現させ、それぞれのタンパク質を精製した。これらタンパク質の中で発現・精製できたCaspr2、Caspr5とNB-3の相互作用をBiacoreにて解析した。結果、Caspr2と強い相互作用が確認できた。この結果からCaspr2がNB-3の結合パートナーである可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
小脳顆粒細胞初代培養を用いた実験により、CS-E刺激によるシグナル伝達因子のリン酸化がNB-3モノクローナル抗体cross-link刺激と同様の結果が得られたことから、CS-Eによるシグナル伝達経路の解明ができた。さらに、NB-3の結合パートナーの候補も見出すことができたため、NB-3が介在するシグナル伝達の探索を目指した研究が進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
さらなるNB-3の結合パートナーの解析のため残りのCaspr familyタンパク質の発現・精製を行っており、続いてBiacoreにて相互作用の解析を行う予定である。
小脳顆粒細胞を用いた細胞培養系でCS-Eのシグナル伝達の解析を行ったが、小脳の平行繊維とプルキンエ細胞間のシナプス形成は細胞培養系で評価することが困難ため、小脳の構造を保ったまま培養可能な小脳スライス培養を用いて、CS-Eまたはそのシグナル伝達因子がシナプス形成に関与することを明らかにする。
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