| Project/Area Number |
23K14375
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 47050:Environmental and natural pharmaceutical resources-related
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
今野 翔 東京薬科大学, 薬学部, 助教 (70882190)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | チオエステラーゼ / ペプチド環化酵素 / 非リボソームペプチド合成酵素 / 遷移状態アナログ / 環状ペプチド / 天然物 / NRPS / Macrocyclic peptide / Thioesterase / Transition-state analog / Phosphonate inhibitor |
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| Outline of Research at the Start |
天然化合物にみられる環状ペプチドの多くは、非リボソームペプチド合成酵素（NRPS）の環化酵素であるチオエステラーゼ（TE）によって環化される。近年、TEを利用した環状ペプチドの化学酵素合成が可能になりつつある。これまで、TEの酵素的性質やタンパク質立体構造は明らかにされてきたが、TEが基質ペプチドを環化する際の詳細な相互作用や構造変化はいまだ明らかになっていない。そこで本申請課題では、TEによる環化反応における基質-TE間相互作用の分子レベルでの解明に向け、TEと共有結合を形成可能な遷移状態ペプチドアナログの開発を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
生理活性を有する多くの非リボソームペプチドは環状ペプチド構造を有しており、生合成酵素中に存在するチオエステラーゼ（T E）ドメインによってペプチドの環化反応が触媒される。環状ペプチド天然物誘導体の効率的合成に向けて、TEは有用な生体触媒として期待されている一方で、TEが基質ペプチドを環化する際の構造変化や基質-TE間相互作用に関する知見は極めて乏しく、TEがなぜ特定のペプチドを環化できるか明らかになっていない。本研究では、TEによる環化反応における基質-TE間相互作用の分子レベルでの解明に向け、TEと共有結合を形成可能な遷移状態ペプチドアナログの開発を行う。
まず、TEの活性中心と共有結合する反応性基の探索を行なった。TEはセリン加水分解酵素であることから、対応した反応性基を検討したところ、4-ニトロフェノールを有する混合リン酸ジエステル（PNP）が安定性、反応性共に優れていることがわかった。続いて、チロシジン合成酵素のTEであるTycC-TEを標的として、PNP構造をC末端に有するチロシジン直鎖ペプチド（TLP-PNP）を合成した。大腸菌を用いて異種発現したTycC-TEとTLP-PNPを反応させたのち、MALDI-TOF-MSを用いて分子量の変化を解析した。その結果、狙い通りTycC-TEとTLP-PNPが安定な複合体となっていることが明らかとなった。また、TycC-TEの活性中心をアラニンに置換した変異体で同様の実験を行ったところ、複合体は得られなかったことから、TLP-PNPはTEの活性中心と共有結合を形成していることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
TEの活性中心と不可逆的に反応する反応性基を見出し、直鎖ペプチドに組み込んだ化合物の合成法を確立した。また、TycC-TEを用いて複合体が獲得できるか検証し、目的の直鎖基質-T E複合体を得ることに成功したことから初年度の目的以上の成果を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は計画通り、直鎖ペプチドではなく環状ペプチド型の遷移状態アナログ合成を行っていく。このような合成は報告例がないことから、さまざまな合成ルートを検証していく。また、すでに獲得したTycC-TE複合体の構造解析も同時に試みる。
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