| Project/Area Number |
23K14446
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 48030:Pharmacology-related
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
清水 聡史 静岡県立大学, 薬学部, 助教 (90969437)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 敗血症 / 性差 / 敗血症性多臓器不全 / オミクス解析 / 膜タンパク質 |
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| Outline of Research at the Start |
敗血症の重症度や死亡率には性差があるため、敗血症時に性差が生じている部分が重症化に関わっていると考えられるが、いまだに詳細は解明されていない。敗血症などの炎症反応にはToll様受容体(TLR)などの炎症関連受容体、重症化に関わる腎臓障害や循環不全には膜輸送体などの関与が知られ、敗血症の性差形成には膜タンパク質の関与が示唆される。そこで本研究は心臓・腎臓に焦点を当て、敗血症モデルマウスにおける生理機能の性差解析、敗血症病態の膜タンパク質ネットワークの網羅的性差解析、遺伝子改変マウス・細胞系における重症化機構の探索、を行うことにより性差を足がかりとした重症化メカニズムの解明を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は敗血症モデルマウスの作成・サンプルの作成を中心に進めた。
腸内細菌叢には性差があることが知られており、その違いが重症度の性差につながる可能性があるため、条件を統一するために糞便懸濁液腹腔内投与法を試すこととした。同一ロットの懸濁液を使うことで安定した重症度を示す敗血症モデルマウスを作成する条件を決定した。
次に糞便懸濁液腹腔内投与法にてFCGマウスを敗血症を惹起させ、心臓・腎臓の採取を行なった。現在のところ、腎臓のサンプルは全て採取完了し、心臓を現在進めている。
採取した腎臓サンプルからRNAの抽出・精製を行い、マイクロアレイ測定を行なった。Transcriptome Analysis Consoleを用い解析を行い、RNA転写量の定量化を行なった。このデータを用い、主成分解析を行なったところ、性染色体・性腺の違いにより群分けされていた。また、正常な腎臓のマイクロアレイ解析と比較したところ、敗血症群・正常群で2群に別れていることも明らかになった。その後、バイオインフォマティクス解析を行ったところ、性差遺伝子・性差のあるパスウェイを明らかとなった。この中には敗血症の重症化に関与が知られている分子群も含まれていた。
腎臓のプロテオミクス解析に向け、腎臓近位尿細管刷子縁膜小胞の精製方法について検討を行った。凍結した腎臓をホモジナイズした後、遠心法にて膜タンパク質画分を取得し、カルシウムイオンを用いて腎臓近位尿細管刷子縁膜を小胞として沈殿させることにより、サンプル精製を行うことができ、プロテオミクスを行う準備が整った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は敗血症モデルマウスの条件を決定し、安定して作成することができた。また、今後の実験を考慮して一度に多くの糞便懸濁液を作ることができたため、同じ条件で今後も敗血症を惹起することが可能になった。FCGマウスの心臓・腎臓サンプルの収集も順調に進んでおり、腎臓は予定サンプル数、心臓はサンプルを採取するための交配も順調に進んでおり、すぐにサンプルの回収が完了すると考えられる。さらに、腎臓ではマイクロアレイ解析が完了し、プロテオミクス解析のための実験手法の確立も完了したため、現在ボトルネックとなるような問題は発生していない。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は心臓サンプルの採取を継続するとともに、腎臓のプロテオミクス・心臓のマイクロアレイ・プロテオミクスを進めていき、データが揃うごとにバイオインフォマティクス解析を進めていき、敗血症重症化に係わる重要な経路を明らかにする。また、昨年度予算が余ったことや、RNA-seq解析を外注せずに自身で行えるようになったことから、心臓のマイクロアレイ解析をRNA-seqに変更し、より多くのデータを取得することも考慮に入れる。
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