| Project/Area Number |
23K14509
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 49040:Parasitology-related
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
鬼塚 陽子 群馬大学, 大学院保健学研究科, 助教 (30710058)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | Trypanosoma cruzi / オートファジー / SNARE 複合体 / vacuolar protein sorting / シャーガス病 / 宿主応答 |
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| Outline of Research at the Start |
中南米で流行するシャーガス病の原因寄生虫Trypanosoma cruziは、宿主防御反応を回避することで生き延びているが、その回避機構の詳細は未だ解明されていない。申請者は宿主病原体排除機構の一つ「オートファジー」に焦点をあて、これまでに原虫感染細胞において、宿主オートリソソーム形成が抑制されていることを明らかにした。そして、オートリソソーム形成に関わるSNARE 複合体との相互作用因子を探索した結果、いくつかの原虫側因子を同定した。これらの機能を解明するために、ノックアウト原虫を樹立し、in vitro、in vivo の実験系を用いて解析することで、病態形成に対する影響を評価する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Trypanosoma cruzi (T. cruzi) は中南米で流行するシャーガス病の原因寄生虫であり、宿主防御反応を回避することで生き延びているが、その回避機構の詳細は明らかにされていない。宿主病原体排除機構の一つ「オートファジー」に焦点をあて、これまでに原虫感染細胞において、宿主オートリソソーム形成が抑制されていることを明らかにし、報告した。その後、オートリソソーム形成に関わるSNARE 複合体との相互作用因子を探索した結果、いくつかの原虫側因子を同定した。本研究では、同定された因子の中でも液胞輸送に係るVPS (vacuolar protein sorting) タンパク質に着目し、研究を進めた。
今年度は原虫感染細胞内における、T. cruzi Vps16 (TcVps16) の局在を調べるために、外注で作製したTc Vps16 抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、共焦点顕微鏡により観察を行った。その結果、感染9時間後の宿主細胞内に存在する無鞭毛期虫体（amastigote）の細胞質内において、Tc VPS16 は点状に偏りなく存在していることが明らかになった。また、同時に市販のhuman Vps16 (hVps16) 抗体を用いて、原虫との交差性の確認した結果、hVPS16抗体では原虫は染まらないことを確認した。一方、非感染細胞質内のhVPS16 は検出できなかった。さらに、ウエスタンブロット法を用いて、非感染HeLa 細胞ライセート中のhVPS16タンパク質発現量を調べたが、バンドは検出されなかった。これらの結果から、宿主細胞内のhVPS16 タンパク質発現量が低く、現状では宿主と原虫それぞれのVps16 の細胞内局在を同時に捉えることが困難であるため、hVps16抗体の再検討及び、tag付きhVps16 強制発現細胞の樹立が必要であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
上述の実験に時間を要し、当初の予定である、SNARE 複合体 とTcVPS16 の結合部位を調べるためのFRET の系の構築や、変異型TcVps16 リコンビナントタンパク質の作製ができず、両者の結合部位の解明まで至らなかったため、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和6年度は、SNARE 複合体とTcVps16 が感染細胞内で結合しているかどうか調べるため、TcVPS16 抗体と原虫感染細胞ライセートを用いた免疫沈降法を行い、ウエスタンブロット法で各SNARE 複合体のバンドが見られるか検証する。その後、宿主細胞内における結合の可視化を目指し、FRET あるいは近位依存性ビオチン化酵素（AirID）のシステムを構築する。また、蛍光抗体法で観察できなかったhVPS16 の強制発現細胞を作製する。それと同時に基礎的な情報を得るために、感染細胞におけるhVPS16 遺伝子発現量を経時的に追う予定である。
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