消化管神経内分泌細胞癌におけるDLL3内包EVsのEMT誘導メカニズムの解明

• Project/Area Number: 23K14575
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 50010:Tumor biology-related
• Research Institution: Osaka Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 松尾 謙太郎 大阪医科薬科大学, 医学部, 助教 (90882176)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: DLL3 / EVs / 消化管神経内分泌細胞癌

Outline of Research at the Start

Notch受容体の一つであるDelta-like-3（DLL3）が、癌細胞の分化の制御調節機構である上皮間葉転換（Epithelial-Mesenchymal Transition; EMT）を調整し転移や浸潤に関与している。さらに注目したのが細胞外小胞：Extracellular vesicles（EVs）で、癌細胞から放出され細胞間のコミュニケーションツールとして癌の浸潤・転移に深く関与している。本研究では、消化管神経内分泌細胞株のECC細胞からのEVsの機能をDLL3とEMTを中心に解明することで、消化管神経内分泌細胞癌の浸潤・転移の機構を明らかにし治療戦略の基盤を構築する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、消化管神経内分泌細胞癌（GI-NEC）の細胞株から放出されるエクソソーム（EVs）に内包されるDelta like 3 (DLL3)と上皮間葉転換（EMT）を中心に解明することで希少腫瘍であるGI-NECの浸潤・転移の機構を明らかにし、治療戦略の基盤を構築することである。
本年度は、直腸GI-NEC由来の細胞株（ECC4）と胃GI-NEC由来の細胞株（ECC10）からEVsを回収し、その特徴を解析することとした。ECC4およびECC10の2種類の細胞株を、それぞれEVs回収用FBS入りの状態で培養し、超遠心法でEVsを回収した。Western Blotting（WB）法を用いてEVsマーカーの発現を解析したところ、両細胞のEVsで、CD9、CD81、TSG101の発現を認めた。また、電子顕微鏡により、100nm以下のEVsを確認した。ナノ粒子解析システムで粒度分布解析を行ったところ、ECC4由来のEVsは中央値130nm、ECC10由来のEVsは中央値113nmの粒子が分布していることが判明した。
さらに、WB法でECC4およびECC10細胞から回収されたEVs内にDLL3が発現していることを見出した。EVs内のDLL3が癌細胞間のコミュニケーションツールとして機能し、癌の浸潤や転移に関与している可能性が考えられた。次に、ECC4およびECC10細胞にsiRNA/DLL3を導入し、DLL3の発現を抑制したのちにEMT関連遺伝子（Snail、E-cadherin、N-cadherin、Slug）の発現をWB法で評価したが、発現量に変化は認められなかった。
以上より、ECC4およびECC10細胞から正確にEVsを回収することができ、そのEVs内にDLL3が発現していることを確認した。今後は、EVs中のDLL3の機能解明と応用可能性について研究を進める必要がある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画として、2023年度でECC4・ECC10 細胞からのEVsの回収と特徴を解析することおよびsiRNA/DLL3の導入されたECC4・ECC10細胞からEVsを回収し、EVsを解析する予定であった。
実際はsiRNA/DLL3の導入されたECC4・ECC10細胞においてEMT関連遺伝子の発現をWB法のみでしか確認していない。やや進捗状況としては遅れているため、次回はECC4・ECC10細胞にsiRNA/DLL3を導入しDLL3の発現を抑制した状態でEVsを回収し、EMT関連遺伝子（Snail、E-cadherin、N-cadherin、Slug）の発現をWB法で評価しEVsの機能解析を予定している。

Strategy for Future Research Activity

現時点で、ECC4・ECC10細胞からEVsが回収でき、さらにEVs内にDLL3が発現していることがわかっている。ECC4・ECC10細胞にsiRNA/DLL3を導入しDLL3の発現を抑制した状態でEVsを回収し、EMT関連遺伝子（Snail、E-cadherin、N-cadherin、Slug）の発現をWB法で評価しEVsの機能解析を予定している。同時に、このEVsを胃癌・大腸癌細胞株に暴露させたのちに、浸潤能・遊走能を評価することとしている。
予想された事象がみられない場合は、EMT以外に癌関連線維化芽細胞や腫瘍血管内皮の変化を確認する。また、ECC4・ECC10細胞をsiRNA DLL3を導入しDLL3の発現を抑制した状態でEVsを回収し次世代シークエンサーを用いて遺伝子およびmicroRNAを網羅的に解析し、GI-NECにおけるDLL3の役割およびmicroRNAとの関連性を検討することを考えている。
さらに、食道GI-NEC由来の細胞株を当科で保有しているため、胃・直腸由来のGI-NECのみにDLL3が高発現しているのではなく、他の消化管由来でも発現していることを確認する。DLL3が高発現している場合は、siRNA/DLL3を用いてDLL3の発現を抑制し、細胞増殖の変化やその際の遺伝子変化を確認し、食道GI-NECにおいてもECC4・ECC10で生じた内因性アポトーシスの誘導（既報で報告済）が同様にみられるかを検討する予定である。
なお、食道GI-NECにおいてはすでにWB法では、DLL3が高発現していることが予備実験として確認できた。siRNADLL3を導入することで細胞増殖が抑制されるのであれば、ECC4・ECC10と同様の事象が生じることが期待される。それらの結果がまとまり次第、学会発表・論文報告を考えている。