膵癌オルガノイドを用いた形態学的サブタイプ分類の試みと臨床応用

Research Project

Project/Area Number	23K15013
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 53010:Gastroenterology-related
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	植田圭二郎九州大学, 大学病院, 助教 (90968596)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000) Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	膵癌 / オルガノイド / 個別化医療 / 超音波内視鏡下穿刺吸引法 / 薬剤感受性
Outline of Research at the Start	切除不能膵癌患者における化学療法においてその有効性・安全性を事前に予測することは難しく、個別化医療は未だ確立されていない。われわれはこれまでに超音波内視鏡下穿刺吸引法の組織検体から膵癌オルガノイド樹立に成功し、その形態学的サブタイプ分類が臨床予後や薬剤感受性に相関している可能性を見出した。この形態学的サブタイプ分類は短い期間（1－2週間）で患者にフィードバックが可能であり、化学療法レジメン選択の根拠となり得る。本研究では膵癌オルガノイドを用いた形態学的サブタイプ分類の分子遺伝学的特徴を明らかにすることで個別化治療を確立し、切除不能膵癌患者の予後延長に大きく寄与することを目指す。
Outline of Annual Research Achievements	1)オルガノイドの樹立・ライブラリー構築：　申請者らは超音波内視鏡下穿刺吸引法（EUS-FNA）検体を用いて膵癌患者由来のオルガノイド（patient-derived organoid; PDO）樹立を継続し、これまでに30株のPDO樹立に成功した。本研究ではPDO樹立成功率の更なる向上を得るために腫瘍径や病期、腫瘍マーカーなどの臨床病理学的因子がPDO樹立に関連するかを検討し、FNA検体を酵素処理しシングルセル化した段階での生細胞数が重要なPDO樹立成功因子であることを明らかにした。FNA一回穿刺分のみでPDO樹立に十分なサンプル量が得られることを確認しており、膵癌診断時のEUS-FNAから無理なくPDO樹立が可能であることを確認した。 2)オルガノイドの形態学的分類とサブタイプ分類への応用：申請者らはPDOの形態学的分類（A type・B type）を発見しているが、この形態学的分類がMoffittらの従来の分子サブタイプ分類と相関することを明らかとした。トランスクリプトーム解析（RNA-seq）から遺伝子発現パターンの相同性を確認し、代表マーカーであるGATA6（Classical subtype）、CK5（Basal-like subtype）の蛋白発現パターンも相関することを免疫染色で確認した。さらに臨床データとも照らし合わせて、形態学的分類で全生存期間が有意に異なることが明らかとなった。これらの結果から、PDOの形態学的分類が分子サブタイプや臨床経過の予測に有用である可能性があると考えている。 3)薬剤感受性の評価：膵癌の代表的な治療薬であるゲムシタビン(GEM)を使用し、PDOの薬剤感受性をGEMに対するIC50値から評価した。形態学的分類でGEMへの感受性が有意に異なることが再現性をもって確認でき、この結果は実臨床の治療反応性とも相関していた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason これまでにオルガノイドライブラリーを構築しており、徐々に樹立数も伸びている。予備実験で観察されていた形態学的分類と既報のサブタイプ分類の相関性、臨床データとの関連性、薬剤感受性についてPDO数を増やして検討しても再現性が確認されており、十分に検証できていると考えている。当初の仮説と矛盾せず、実験を進行することができている。現時点までの実験結果を集約し、論文投稿中である。
Strategy for Future Research Activity	これまでに樹立したPDOを用いた遺伝子発現解析から、膵癌は既報の通り患者ごとの差が大きい非常にヘテロな集団であることを確認した。この点においても患者一人ひとりの腫瘍の性質を反映するPDOが膵癌研究に適していると考える。現在、PDOの樹立数は少しずつ増加しているもののまだ十分とはいえず、今後もPDOライブラリーの拡充を図る。また、現在はPDOを用いたin vitroでの薬剤試験のみであるが、今後は免疫不全マウスへの移植の実験系を確立することで、in vivoでの薬剤試験や増殖・転移に関わる因子のさらなる研究を進めていく（＝膵癌の本態解明へ向けた研究）。実臨床への応用としては、PDOの形態分類から分子サブタイプをより短期間で予測する(=Turn around timeの短縮)により、治療選択へとつなげていきたいと考えている。また、PDOを用いた薬剤評価に関しても今後オキサリプラチンやイリノテカン、パクリタキセル、5-FUなどの膵癌の既存薬に加え、分子標的薬など可能な限り網羅的に評価し、膵癌の新たな治療標的の探索を行う（＝PDOを用いた個別化医療の推進へ向けた研究）。