尿毒症状態における免疫障害に対するMg負荷の効果に関する研究

• Project/Area Number: 23K15253
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53040:Nephrology-related
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 田中 佑典 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00612110)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2025: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: Klotho / Mg / 慢性腎不全 / マグネシウム / 免疫

Outline of Research at the Start

腎不全モデルとしてアデニン誘発ラットを用いて、末梢血総リンパ球数(PBMCs)およびT細胞数、B細胞数（Klotho陽性細胞数）、NK細胞数に腎不全によりどのような変化を認めるか、さらにMg欠乏もしくは負荷食による変化も観察検討する。
また、腎不全状態ではB細胞からのKlotho切断能が亢進し、Klotho陽性B細胞数が減少することから、腎不全状態でのB細胞からのKlotho切断能に対してMg負荷によりどのように影響するかを検討する。
また、重症化リスクが高い糖尿病、肥満状態での末梢血リンパ球への影響およびMg欠乏もしくは負荷食による影響を検討する。

Outline of Annual Research Achievements

初年度として、FACS手技、Western Blot手技のプロトコル作成を行う方針とした。
令和6年度実施予定であったマウスリンパ腫由来細胞株であるA20を用いて尿毒症状態におけるKLOTHOの変化を確認するために患者血清を添加し培養実施した。過去の論文の再現性を確認すべく（ Immun Inflamm Dis. 2020 Jun; 8(2): 228-235. ）、健常人血清、透析患者血清を添加した培地でA20細胞を培養し、FACSで解析を行い、 cleavage of klotho indexの測定を行い再現性を確認した。その際、蛍光強度に有意な変化をつけることができなかった。次に、予備実験として1度の実験で必要血清量を把握するため当講座で冷凍保存していたマウス血清、ラット血清を用いて、KLOTHOの蛍光強度の変化を確認したが、同様にKLOTHOの蛍光強度に変化をつけることができなかった。上記に伴い、FACSにおいて有意な変化を認める実験条件の設定に難渋している。
その他の方法で評価が可能かを確認するために、過去の実験の再現性確認のため、健常人血清、透析患者血清での培養、追加でFBSでの通常培養、通常マウス血清、腎不全モデルマウス血清、通常ラット血清、腎不全モデルラット血清を用いてA20細胞を培養し、24時間培養実施後の上清をウエスタンブロッティング実施し、上清中のKLOTHOを確認した。
in vitroでの変化を捉えることができていないため、in vivoにおけるマウス臓器での発現を確認した。脾細胞において、KLOTHO, FGFR1, FGFR4, FGF23 の発現を確認している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

予備実験として過去の再現性を確認したが、再現が得られず、各実験手技における実験条件の設定に難渋している。各血清によるKLOTHOの変化に対して、Mg添加によりどのような影響を及ぼすのかを検討する仮説であるが、FACSにおける蛍光強度評価については、現段階でプロトコルを再検討中である。マウスリンパ腫由来細胞株であるA20においてKLOTHOが発現していることはWestern Blot、ｑPCRを用いて確認を行ない発現を認めていることは確認できているが、FACSにおけるKLOTHOの蛍光強度評価：（cleavage of klotho index）については血清間において有意な変化を認めていないため、KLOTHOの変化をどのように捉えるかを検討中である。
マウスリンパ腫由来細胞株であるA20において、腎不全血清でA20細胞表面のKLOTHOが切断されることを確認のため、各血清添加培地で培養を行なった上清をWestern Blot実施したが、有意なバンド認めなかった。その際、培養したA20細胞には KLOTHO発現していることを確認するため、ウエスタンブロッティング 実施したところ、各種血清添加で培養したA20細胞ではKLOTHOのバンドが確認できた。そのうちで健常人血清でバンドが濃く出ていることが判明している。

Strategy for Future Research Activity

KLOTHOの変化を確認する適切な実験条件が定まっておらず、調整中である。
In vitroにおいてマウスリンパ腫由来細胞株であるA20に対してTNF-αなどを直接作用させて、KLOTHOの変化を評価する実験条件を設定し、それを踏まえてMg濃度の変化によるKLOTHOの変化について検討を行う。
上記が困難な場合は、マウス、ラットの臓器においてKLOTHOの発現を捉えることができるのであればin vivoにおいて、腎不全モデルマウスを作成し、アデニン食、低マグネシウム アデニン食、高マグネシウム アデニン食を作成し、8週間飼育、解剖し、脾細胞でのKLOTHOの発現に変化を認めるかを検討予定である。
また、腎不全モデルマウスラットを作成し、腎不全状態がリンパ球に及ぼす影響およびMg欠乏や負荷に生じる影響を観察する予定である。