| Project/Area Number |
23K15371
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 54030:Infectious disease medicine-related
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
橋倉 悠輝 宮崎大学, 医学部, 副臨床検査技師長 (50867182)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | ATL / HTLV-1 / CRISPR/Cas9 / provirus |
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| Outline of Research at the Start |
ATLやHTLV-1に関連した慢性炎症性疾患の発症機構にHTLV-1の調節遺伝子であるtax遺伝子およびアクセサリー遺伝子であるHBZ遺伝子が重要な役割を果たしていると考えられている．しかしながら，HBZ遺伝子はATL細胞で恒常的に発現しているが，ATL細胞におけるその機能は十分に解明されていない．今回，遺伝子の失活や遺伝子導入などゲノム編集の目的で広く用いられるツールになっているCRISPR/Cas9を利用し，ヒトゲノムに組み込まれているプロウイルスの特異的編集による失活，すなわちHTLV-1感染症やHTLV-1関連疾患の治療法開発の手掛かりになる可能性があり本検討を計画した．
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，CRISPR/Cas9で HBZ遺伝子を失活させることで、HBZ遺伝子の機能解明やHTLV-1 の分子メカニズムを明らかにすることを目的とする.
まず，CRISPR/Cas9で使用するSynthetic guide RNA (sgRNA)の設計を行った．sgRNAは，CRISPR/Cas guide RNAデザインソフトウェアCRISPRdirectを用いてHBZ遺伝子配列（Accession no.AB219938）から候補配列を検索した．候補配列の検索結果より，5つのsgRNAの設計した．設計したsgRNAはエレクトロポレーションを用い，HTLV-1感染細胞株に導入を行った．CRISPR/Cas9導入にはInvitrogen Neon Transfection System kit (Thermo Fisher SCIENTIFIC)を用いて，添付書に従って実施した．CRISPR/Cas9によるトランスフェクション2日後に細胞を回収し，HBZ遺伝子配列への変異導入の有無をスクリーニングした．その結果，HBZ遺伝子配列の変異導入が確認でき，かつ最も変異導入効率の高いsgRNAを選択できた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和5年度の目標である変異導入効率の高いsgRNAを選択することができた．また，今回作成したsgRNAを用いてHTLV-1感染細胞株やATL細胞株へのトランスフェクションの実施および解析を開始している．
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| Strategy for Future Research Activity |
変異導入効率の高いsgRNAを選択できた．また，作成したsgRNAを用いたCRISPR/Cas9によるトランスフェクションを行ったところ，HBZ遺伝子配列の変異導入が確認できた．今後は，HTLV-1感染細胞株やATL細胞株にてCRISPR/Cas9で HBZ遺伝子の失活を試み，HBZ遺伝子配列の欠損や挿入などの解析，HBZやtax mRNAの発現およびオフターゲット効果の解析を進める計画である．
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