in vivoリバイバルスクリーニングを用いた新規のVLDL分泌関連分子の同定

• Project/Area Number: 23K15390
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 54040:Metabolism and endocrinology-related
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 内田 啓一郎 京都大学, 高等研究院, 特定研究員 (80869701)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2024: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: VLDL / in vivo screening / 肝細胞 / Apob / sgRNA library / 脂質代謝 / CRISPR-Cas9 / リポタンパク質

Outline of Research at the Start

我が国の非アルコール性脂肪性肝疾患の有病率は高いにも関わらず未だ十分に有効な薬物療法は確立していない。これまでの研究で肝細胞からの超低密度リポタンパク( VLDL)の分泌障害は、肝細胞内に脂質が蓄積することでNAFLDのリスクとなることが示されているが、VLDL分泌メカニズムは十分に解明されていない。本研究ではCRISPRスクリーニングを改良したリバイバルスクリーニングをin vivoで用いることで、肝細胞からのVLDL分泌に関わる分子群を網羅的に同定し、in vitroでの機能評価並びにマウスを用いたin vivoでの過剰発現・遺伝子欠損での表現型の解析を目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

今年度はin vivoスクリーニングのシステムの確立を行った。当初、生体内への肝細胞へのレンチウイルスベクターのトランスダクションが困難であったが、方法を改良し、高率にレンチウイルスを感染させる方法を新規に確立した。実際にレンチウイルスライブラリーを生きたマウスに投与し、肝細胞を回収し、取り込まれたsgRNAを次世代シークエンサーで解析したところ、実際にソート予定の細胞数の1％の細胞から、ほぼすべてのsgRNAを検出でき、十分なカバレッジを確認できた。
またこれまでセルソーターでの大規模なソーティングは困難とされていたが、こちらについても新規の手法を樹立し、スクリーニングを可能とできるだけの十分な肝細胞をソーティングすることを可能とした。
当初、細胞内Apobの検出を抗Apob抗体にて検出する方針としていたが、商業ベースで販売されている抗Apob抗体で、フローサイトメトリーで使用可能なクオリティを有するものはなかった。そこでApobにHAタグを付加したノックインマウスを作成し、抗HAタグ抗体にて検出を行う方針に切り替えた。実際に、CRISPER-Cas9の技術を用いてApobにHAタグを付加したマウスの作成に成功し、Apobが抗HA抗体にて検出・定量化が可能であることを確認した。現在Cas9のノックインマウスとの交配を行いダブルノックインマウスを作成している最中であり、順調に交配が進んでいる。
またin vivoでウイルスを用いて肝細胞の遺伝子を効率的にノックアウトするシステム、および過剰発現するシステムについても樹立した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

レンチウイルスの肝細胞への導入、肝細胞のソーティング、Apobの検出など、当初計画を進める中で、複数の障害が見つかったが、そのすべてに解決策を樹立することができ、スクリーニングを進めるに値する充分なsgRNAカバレッジを確認できた。Apobの定量化の方法についても樹立でき、あとは交配を進め、スクリーニングを行うのみである。
スクリーニングで特定した遺伝子の機能解析をin vivoで行うためのシステムについても樹立し、スクリーニングの結果をシームレスにin vivoの機能解析へ繋げることができる状態にある。

Strategy for Future Research Activity

作成したノックインマウスとCas9ノックインマウスとの交配を進め、ダブルノックインマウスを作成し、樹立した方法でレンチウイルスライブラリーの感染を行い、肝細胞を回収し、抗HAタグ抗体で免疫染色を行い、樹立した方法でスクリーニングを進める。
これまでin vivoで直接肝細胞の表現型を行うスクリーニングの方法は細胞増殖に関連する表現型に限られていた。その中で今回樹立した肝細胞の表現型のスクリーニングの手法はあらゆる表現型への拡張の可能性を有しており、既に医学的に重要な別の肝細胞の表現型についてのスクリーニングについても進める。