| Project/Area Number |
23K15421
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 54040:Metabolism and endocrinology-related
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
高野 智圭 日本大学, 医学部, 助教 (50845310)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | ヒト羊膜上皮細胞 / Wnt経路 / 多能性と分化 / 先天性代謝異常症 / TNIK |
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| Outline of Research at the Start |
ヒト羊膜上皮細胞は胎盤を覆う羊膜から分離できる多能性幹細胞である。代表者はこれまでこの細胞の多能性と分化の制御機構に着目し、in vitroにおける細胞分化にはTGF-β経路に依存する上皮間葉転換が関与することを示した。また一連のプロセスにはWnt/β-catenin経路の介在がある可能性を見出し、TGF-β経路が幹細胞の運命決定に関わるWnt経路のスイッチング機構をも制御していると考えた。本研究はこのスイッチング機構に関する新たな仮説の検証を通して、羊膜上皮細胞における自己複製の運命決定機構の解明を目指すものである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該施設における倫理委員会承認のもと、対象となる妊婦から書面の同意を得て、定期的に胎盤からヒト羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells: hAEC）を分離・保存し、検討に用いた。
「目的①：TNIKとTCF7L1/L2の関係」TGF-β阻害剤であるSB-431542を添加して培養したhAECにおいて、Traf2- and Nck- interacting kinase（TNIK）の経時的発現をmRNAレベルで評価したところ、培養日数を経るにつれて発現が上昇することがわかった。しかし全細胞ライセートを用いたWestern Blot法ではTNIKの蛋白発現を確認することが出来なかった。
「目的②：Wnt経路におけるp300/CBPのパートナー」7日間培養したhAECの核蛋白を抽出しWestern Blot法で解析したところ、SB-431542添加群および対照群ともにβ-cateninが核内に発現することを確認した。さらにSB-431542添加群では、核内におけるTCF7L1の蛋白発現が、対照群と比して有意に増加していることがわかった。一方でTCF7L2の発現は二郡間で有意差を認めなかった。
「目的③：TCF7L1の機能解析」多能性の維持に関わっていると想定しているTCF7L1の機能解析のため、siRNAを用いたノックダウン実験を行った。Lipofectamine試薬を用いたトランスフェクション後にhAECのTotal RNAを抽出し、RT-qPCRを行ったところ、TCF7L1のmRNA発現が有意に低下し、TCF7L2のmRNA発現には影響しないことを確認出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の仮説を導き出した予備実験は、TCF7L1/L2の遺伝子発現解析に留まっていたため、詳細な蛋白発現解析が必要であったが、当該年度は細胞内蛋白質を分画毎に抽出することや、免疫沈降法およびWestern Blot法を行う体制を構築することが出来た。実験開始当初は純度の高い複合体蛋白質の沈降に難渋したため、Wnt経路が活性化状態にあるヒト大腸癌細胞株であるSW480を用いて検証実験を繰り返し、抗体、ビーズやプロトコルを概ね最適化することが出来た。来年度からは本格的にhAECを用いた検証に移行する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
「目的①：TNIKとTCF7L1/L2の関係」TNIKのWestern Blot法による検出系を見直すとともに、必要があれば細胞の核もしくは細胞質の分画を用いて発現解析を行い、細胞内の局在について検証する予定である。
「目的②：Wnt経路におけるp300/CBPのパートナー」hAECのSB-431542添加群および対照群から核蛋白を抽出し、共免疫沈降法を用いて、TCF7L1およびTCF7L2のどちらがp300/CBPと複合体形成しているのかを明らかにしたい。TCF family以外のp300/CBPのパートナーが考えられる場合は、プロテオーム解析によって候補蛋白の絞り込みを検討する。
「目的③：TCF7L1の機能解析」siRNAの至適濃度と培養期間についてさらなる条件検討を行った後、TCF7L1をノックダウンしたhAECの特徴を詳細に解析する予定である。
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