| Project/Area Number |
23K15483
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
|
|---|
| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
|---|
Principal Investigator |
松本 倫典 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (90529760)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
|
|---|
| Keywords | 肝細胞癌 / p53 / ユビキチン / 脱ユビキチン化酵素 / USP10 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
肝細胞癌は腫瘍の悪性度と障害肝による再発率の高さのため癌関連死亡の中でも本邦第3位を占める予後不良な悪性腫瘍である。野生型p53を有する肝細胞癌は全体の7割を占めるが、アポトーシスを誘導せず、増殖、浸潤、転移を起こしてしまう。野生型p53は細胞における非ストレス時にはユビキチン化され分解され、低酸素やDNA損傷といった細胞におけるストレス時に野生型p53を安定化し、p53の様々な細胞応答を促す。野生型p53にアポトーシスが生じないのはp53の代謝経路に問題があることが予想されたため、我々はp53の脱ユビキチン化酵素USP10に着目し、肝細胞癌切除検体や肝癌細胞株を用いて研究を進めてきた。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
肝細胞癌 は本邦における癌関連死亡の中でも第3位を占める悪性度の高い予後不良な疾患である。癌抑制因子であるp53の野生型を有する肝細胞癌は全体の7割を占めるが、アポトーシスを誘導せず、増殖、浸潤、転移を起こしてしまう。野生型p53にアポトーシスが生じないのはp53の代謝経路に問題があることが予想された。野生型p53を持つ肝癌細胞株および肝細胞癌切除検体を用いてUSP10が分化度や脈管侵襲といった腫瘍の悪性度に与えるメカニズムを解明すること目的とし、研究進めてきた。
癌抑制因子であるp53は、半減期が短い微量タンパク質であり、細胞周期の制御、DNA修復、およびアポトーシスに関わる遺伝子群の転写活性化によるDNA損傷への細胞応答の制御の他に、血管新生の抑制や細胞の老化のといった様々な機能にも関与している。
2024年度は肝細胞癌株を用いて通常培養と低酸素培養を行い、肝細胞癌の進展に重要な機序となる血管新生に対するUSP10の役割を検討した。低酸素下でp53野生型株である肝癌細胞株HepG2細胞において低酸素状態で誘導される転写因子hypoxia inducible factor-1A (HIF-1Aの発現量増加を確認した後、HepG2細胞に対してsiRNAにてUSP10をノックダウンした。低酸素下でp53の不安定化が予想され、実際にVEGFの発現量が亢進することを確認した。低酸素培養を行うことでUSP10によるp53の安定化が生じ、本来VEGF産生抑制が生じるはずであるが、USP10をノックダウンすることでp53の血管新生抑制作用が減少し、VEGF産生亢進が認められたと考えられる。低酸素化などのストレス化において安定型p53に対してUSP10による安定化を促進させる新規遺伝子の探索をすることで新規治療戦略につながると考えられた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
USP10は低酸素や抗癌剤暴露等のストレス下において脱ユビキチン化によるp53の安定化というがん抑制因子として作用する。我々はまず膵癌細胞株PANC-1において低酸素培養を行うと、RNAシークエンスにてTP53の上流遺伝子群の発現上昇が認められたため、TP53が活性上昇することを確認した。続いて我々は野生型p53を発現している肝癌細胞株（HepG2、Huh6、FLC4）および変異型p53を発現している肝癌細胞株（Huh7、PLC）を用いて通常培養と低酸素培養を行った。膵癌細胞株PANC-1と同様に低酸素培養を行うと、RNAシークエンスにてTP53の上流遺伝子群の発現上昇の有無を確認し、TP53が活性上昇するかどうかを確認するための実験を行った。低酸素下でp53野生型株である肝癌細胞株HepG2細胞において低酸素状態で誘導される転写因子hypoxia inducible factor-1A (HIF-1Aの発現量増加を確認した後、HepG2細胞に対してsiRNAにてUSP10をノックダウンした。低酸素下でp53の不安定化が予想され、実際にVEGFの発現量が亢進することを確認した。
野生型p53を発現している肝癌細胞株（HepG2、Huh6、FLC4）および変異型p53を発現している肝癌細胞株（Huh7、PLC）の低酸素培養の条件検討に時間を要し、時間を要した。現在、HepG2細胞以外の肝癌細胞株においてもVEGFとUSP10の関連を確認中である。
USP10が肝細胞癌切除後の予後因子となるかを検討するために肝細胞癌の切除検体25例を用いて癌部・非癌部を抗USP10抗体を用いて免疫染色施行し、癌部、非癌部の染色の程度をスコア化した（染色された細胞の陽性率10％以下をスコア0、11－25％をスコア１、26－50％をスコア２、51％以上をスコア3）。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は①USP10によるp53の安定化が分化度や脈管侵襲といった肝細胞癌の悪性度といかに関わるかそのメカニズムを解析する、②USP10の発現量と背景肝の肝障害度との関連を解析する、③USP10によるp53の安定化にも関わらず、分化度の低下や脈管侵襲の促進をもたらすメカニズムを解明する。
そのためには、野生型p53を発現している肝癌細胞株（HepG2、Huh6、FLC4）および変異型p53を発現している肝癌細胞株（Huh7、PLC）を用いて通常培養下と低酸素培養下での以下の項目について比較検討を行う。１）p53、USP10、HIF-1A 、VEGFのmRNA発現量（リアルタイムPCR法）し、タンパク質発現量の定量（Western blotting法）し、p53、USP10、HIF-1A、VEGFのmRNA発現量とタンパク質発現量との関係を解析する。２）p53、USP10の遺伝子発現に関してsiRNAを用いた抑制を行うことでHIF-1A 、VEGFの遺伝子およびそのタンパク質の発現量の変化を検証する。
さらにp53、USP10のノックダウンした肝癌細胞株に肝癌関連の抗癌剤、分子標的薬、免疫チェックポイント阻害剤を添加し、細胞増殖効果をMTT assay、アポトーシスの有無をWestern blotting法 (Cleaved caspase-3,-8, -9, PARP) およびAnnexin V/FITC assayで評価を行い、薬剤効果と遺伝子発現の関係性を検証する。
臨床検体の癌部に対しp53、USP10およびVEGFに対する免疫染色を、非癌部に対してはp53、USP10に対する免疫染色を行う。その結果と臨床病理学的背景と併せて多変量解析を行うことでp53、USP10、VEGFが臨床的に予後に反映されるか否かを検証する。
|
