iPS由来間葉系幹細胞を封入した自己組織化ペプチドハイドロゲルの心嚢内投与

• Project/Area Number: 23K15549
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 55030:Cardiovascular surgery-related
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 甲斐沼 尚 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 病院, 医長 (40839073)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: iPS / 再生医療 / 人工多能性幹細胞 / 自己組織化ペプチドハイドロゲル / 間葉系幹細胞 / 神経堤細胞 / 心嚢内注入法

Outline of Research at the Start

心不全患者に対する間葉系幹細胞（MSC）移植の治療効果を増幅させるために、我々は組織由来MSCよりも大量培養が容易で老化の少ない高品質を維持しやすい人工多能性幹細胞（iPSC）由来MSCを使用し、従来の移植方法よりもドナーMSCの生存を著明に改善できる、自己組織化ペプチドハイドロゲルに封入して心嚢内注入するという新たな方法を開発した。本研究の目的は、この多分野の最新技術を駆使した新規治療法（自己組織化ペプチドハイドロゲルに封入したiPSC由来MSCの心囊内注入）の安全性や治療効果を臨床に即した小動物モデルにおいて明確にすることである。

Outline of Annual Research Achievements

パラセアゲルがドナー細胞のretentionに与える影響を評価するため、DiIにてiMSCにラベリングをしたのち、パナセアゲルにiMSCを封入して移植した群と、HBSSにiMSCを混ぜて移植した群において、顕微鏡検査による評価を行った。その結果、iMSC-PG群では手術後3日目と7日目において、大きな塊状の集簇が心表面に付着したまま残存していたが、iMSC-HBSS群では、手術後3日目には心表面に付着した細胞が少数であり、7日目には心膜側へのドナー細胞の付着はさらに少なかった。
ドナー細胞の定量的な保持率を評価するために、iMSCにHBSSまたはPGを投与した後のIPIC後3日および7日に、霊長類特異的なALU遺伝子に対するqPCRにより測定した（各群n = 4-5）。ラットの左心室サンプルからgDNAは、DNeasy Blood and Tissue Kit（QIAGEN）を使用して抽出された。ALU TaqManプローブセットはThermo Fisher Scientificから購入した。各サンプルのDNA量は、ACTBをreferenceとして標準化した。標準曲線を作成するため、LewisラットのLV心筋組織に2 × 104のiMSCsを混合し、ラットの左室心筋と混合したiMSCsの既知濃度を、対応するサイクル閾値（Ct）値に対してプロットすることで確立した。標準曲線の相関係数（r2）は0.999であり、Ct値とターゲットDNAの初期量の対数との間に有効な線形関係が示された。標準曲線を適用することで、各群においてIPIC処理後3日および7日後の細胞保持率を、実験サンプルから得られたCt値を適合させることで精度高く算出した。その結果、移植方法に関わらず、移植後3日目と7日目において移植されたiMSCの約40%が保持されていることが示された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

移植後のドナー細胞の保持率の定量評価を行い、パナセアゲルのドナー細胞保持率に対する影響について確認することが可能であった。一方、iMSC群の心筋再生効果を評価するための遺伝子発現については、実験系の影響でサンプルの採取が困難であり、現在鋭意進行中である。つまり、ラットの薄い心外膜内に細胞を注入し、治療後レシピエント心とドナー細胞を一塊にして摘出することは技術的にかなり難しいことが判明した。そのため、当初計画していた、PCRの実験を完了できておらず、やや遅れていると自己点検にて評価をした。今後はin-vitroの実験系にてiMSCの心筋再生効果について評価を行う方針である。

Strategy for Future Research Activity

今後の方針としては、iMSCの血管新生促進効果の増強とPanaceaGelの組み合わせが心機能改善を促すメカニズムについて評価するため、iMSCを非コーティングまたは0.4%PanaceaGelコーティングしたTranswellで培養するin vitro共培養実験を設定する予定である。また組織学的評価として、免疫染色を行い、in　vitroの結果との関係を確認する予定である。また、ドナー細胞の心臓内分布や生存、異所性集積や腫瘍化について評価するために、心機能評価後に心臓と他の臓器を摘出し、組織学的探索と遺伝子・タンパク発現の定量評価を行う。ドナー細胞はヒト特異的タンパク・遺伝子を免疫染色及びqPCRで解析することで追跡可能である。HE染色にて過剰な炎症反応や腫瘍の形成が無いことを確認し、パナセアゲルの残存も計測する。
また、レシピエント心をドナー細胞を一塊について摘出する手技についてはさらに改良を行い、手術後3日目の各群の左心室組織においてRNAシーケンスを実施し、遺伝子発現の特徴について評価を行う方針である。