| Project/Area Number |
23K15633
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 55060:Emergency medicine-related
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
玉田 尚 横浜市立大学, 医学研究科, 客員研究員 (70439181)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | ARDS / VILI / ネクローシス / メカニカルストレス / メカニカルストレス耐性 |
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| Outline of Research at the Start |
人工呼吸器関連肺障害（VILI）はARDSなどの重篤な患者に合併し，その予後を左右する．その主要因である人工呼吸のメカニカルストレスによるbiotraumaがもたらす炎症を標的とした介入の効果は限定的である．
申請者は人工呼吸がARDSモデルの肺胞上皮細胞に対して，既存のRegulated Necrosis経路の活性化を伴わないネクローシスを誘導することを見出した．そこで，ARDSでは肺胞上皮細胞の細胞骨格構造が変化することで，メカニカルストレス耐性が低下し，ネクローシスが誘導されることによりVILIが惹起されると考え，その機構を解析し，新しい発想のVILI抑制戦略に繋がる治療標的を同定したい．
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，ARDSによって傷害を受けた肺において，肺胞上皮細胞のメカニカルストレスへの耐性がどのように変化しているのか解析し，さらにその分子制御機構を明らかにすることである．最終的には同定された分子制御機構に介入することで，ARDSにおけるVILIを抑制できるような治療標的の同定を行いたいと考えている．
第一段階としてマウス肺胞上皮細胞株MLE12をフィブロネクチンでコーティーングした培養細胞伸展装置用のチャンバーに播種し，24時間培養する．培養後，カゼイン腹腔内投与にて無菌性腹膜炎を起こさせたマウス（C57BL6J）より腹水を採取し，Percollによる遠心分離にて好中球を単離する．単離した好中球をMLE12細胞比4倍の数だけチャンバー内に加え，さらにその直後にLPS（0111:B4）を終濃度1μl/mlの濃度で加え，24時間共培養することで，ARDSをモデリングした肺胞上皮細胞傷害モデルを作成し，正常細胞チャンバーと肺胞上皮細胞傷害チャンバーを培養細胞伸展装置（ストレックス社製自動伸展装置 STB-140）にてストレッチを行うことで，メカニカルストレスを加える．12％伸展・15回/分（低容量肺保護換気を模した条件），12％伸展・30回/分（低容量であるが，頻呼吸を模した条件），20％伸展・15回/分（高容量換気を模した条件）の3条件で，それぞれのチャンバーを伸展し，4時間，6時間，12時間，24時間で培養上清および細胞を回収または固定し,フローサイトメトリーによる死細胞解析やウェスタンブロッティングによる細胞死に関連する因子の同定，細胞骨格の構造変化の観察等を行う．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
ストレッチチャンバーでの細胞培養や死細胞解析，細胞骨格の観察などの条件検討に時間を要し，本実験に進めずにいるため．
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| Strategy for Future Research Activity |
条件検討に時間を要しているが，徐々に条件は整ってきているので2024年度中には本実験を開始できるものと考えている．
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