圧迫性脊髄症治療における膜透過性神経分化誘導ペプチドと脂肪組織由来幹細胞の有用性

• Project/Area Number: 23K15655
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56010:Neurosurgery-related
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 善積 哲也 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 研究員 (00837429)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
• Keywords: ラットモデル / 圧迫性脊髄症 / SOCSタンパク質 / 脂肪組織由来幹細胞 / 脊髄前角細胞 / 膜透過性神経分化誘導ペプチド / ローターロッド / 緩徐進行性 / BCボックスタンパク質

Outline of Research at the Start

圧迫性脊髄症モデルラットは実際の臨床の場でみられる圧迫性脊髄症と同じ慢性進行性の病態経過を辿る。研究代表者は、最近BCボックスタンパク質の中のSOCS（supressors of cytokine signaling）ボックスタンパク質の一つであるSOCS7のBCボックスモチーフを含むペプチドにより脂肪組織由来幹細胞（Adipose-derived Stem Cells：ASCs）のコリン作動性ニューロンへの分化誘導に成功した。本研究では、ASCs及びこの膜透過性神経分化誘導ペプチド用いた圧迫性脊髄症モデルラットに対する治療の可能性を検討する。

Outline of Annual Research Achievements

12週齢、雄のWistar rat（250-290g）に対し、吸水膨張性ポリマーをC5-C6の椎弓下に挿入・留置し、脊髄の慢性圧迫を導入することで圧迫性脊髄症モデルを作成した。脊髄圧迫導入後5週目よりロータロッド持続歩行時間の、8週目より前肢握力の有意な低下が生じ、実際の臨床場で見られるような圧迫性脊髄症と同様に、緩徐進行性の経過を辿った。また脊髄圧迫導入後26週間後においてコントロール群と比較して脊髄圧迫導入群では有意な脊髄前角細胞数の減少が認められた。また、圧迫性脊髄症モデル作成時に、ラットの鼠径部より皮下脂肪組織を摘出し、脂肪由来間葉系幹細胞分離キット(フナコシ)を用いて、ポリエチレン－ポリプロピレン(PE-PP)芯鞘構造の不織布でできた三次元構造基材に、脂肪組織をトラップしてMSC NutriStem XF培地で培養して，脂肪組織由来幹細胞(ASCs)を分離し、培地交換せずに1週間培養、その後1週間から10日で、基材の線維上に組織から線維芽細胞様のASCsが増殖しているのを確認し、1～2週間後、ASCsが基材の10～20％を占めるようになったら、継代培養した。その後SOCS7由来BCボックスぺプチドをASCsの培地中に2μMの濃度で添加し、24時間後以降に、細胞について神経分化を形態学的、免疫細胞化学的（抗NeuN抗体、抗ChAt抗体）に検討し、分化した細胞がコリン作動性ニューロンであることを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

圧迫性脊髄症モデルの作成、さらにラットの鼠径部より皮下脂肪組織を摘出し、脂肪由来間葉系幹細胞を分離・培養し、これにSOCS7由来の膜分化誘導ペプチドを導入することで、脂肪由来幹細胞をコリン作動性ニューロンに分化させることに成功した。上記を安定的に行うことが可能で、今後これらを用いて治療実験を行っていく。

Strategy for Future Research Activity

作成した圧迫性脊髄症ラットモデルを以下の3グループに振り分ける。このモデルは、脊髄圧迫導入後8週間目ではすでに脊髄症が発症し、運動機能が進行性に低下しているため、この時点で治療介入を開始する。Group A：圧迫性脊髄症ラット作成後8週目から週1回生理食塩水を尾静脈から投与(n=12)、Group B：圧迫性脊髄症ラット作成後8週目から週1回生理食塩水に懸濁したASCs(2.5×106cells)を尾静脈から投与(n=12)
Group C：圧迫性脊髄症モデルラット作成後8週目に生理食塩水に懸濁したSOCS7由来膜透過性神経分化誘導ペプチドによりASCsを分化誘導させたコリン作動性ニューロン(2.5×106cells)を尾静脈から投与(n=12)。また、上記と同様のプロトコールで髄腔内移植による治療効果も検討する予定である。免疫組織学的評価：圧迫性脊髄症モデルラット作成後20週間後に還流固定を行い、免疫組織学的な評価へと移行する。C5-6の脊髄圧迫部位を採取して、抗ChAt抗体を用いた前角運動ニューロンの評価を行う。また血管新生などへの影響も調べるために抗VEGF抗体による評価も行う。静脈投与後の細胞動態：［3H］-thymidineを培地に添加し、移植前24時間取り込ませ、ラジオアイソトープ標識したASCsまたはASCsを分化誘導させたコリン作動性ニューロンを圧迫性脊髄症モデルラットに移植し、血液および各臓器の放射活性から各組織に到達した移植細胞の割合を算出する。