Detection of new targeting therapy for Ewing sarcoma targeting with circular RNA

• Project/Area Number: 23K15718
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56020:Orthopedics-related
• Research Institution: University of the Ryukyus
• Principal Investigator: 大城 裕理 琉球大学, 病院, 医員 (10898547)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2026: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000); Fiscal Year 2025: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: Ewing肉腫 / 肺転移能 / 抗がん剤耐性 / マイクロRNA / GFP / サーキュラーRNA / 肺転移

Outline of Research at the Start

Ewing肉腫の抗がん剤耐性や肺転移におけるサーキュラーRNAやマイクロRNAの解析を行う。Ewing肉腫細胞株の親株、抗がん剤耐性株、高肺転移株を対象に以下の課題の検討を行う。1)親株、抗がん剤耐性株、高肺転移株のサーキュラーRNA、マイクロRNAの発現の比較
2)サーキュラーRNAやマイクロRNA、その下流に位置するメッセンジ ャーRNAやタンパク質の発現解析ならびに抗がん剤耐性能獲得、肺転移の促進もしくは抑制効果に関して、in vivoでの比較検討。親株、抗がん剤耐性株、高肺転移株の分子発現を解析し、抗がん剤耐能や肺転移能獲得のメカニズム解明や新規治療法開発につなげる。

Outline of Annual Research Achievements

Ewing肉腫は、手術療法に周術期化学療法を併用することで、予後が改善した疾患であるが、肺転移症例や化学療法に抵抗性がある症例では、治療に難渋する事が多い。Ewing肉腫の転移や細胞増殖能にマイクロRNAが関連していると報告されており、Ewing肉腫の肺転移株や抗がん剤耐性株に関連するマイクロRNAの検索が今後の治療の一助になる可能性がある。Ewing肉腫細胞株に対して、green fluorescent protein（GFP）を形質導入して、細胞内で蛍光を確認した。しかし、セレクションを行ううちにGFPの安定発現を維持できなかったため、細胞内のGFPの発現を安定化させるよう調整している。Ewing肉腫のGFP細胞株を作成して、マウスへ尾静注を行い、肺転移を確認して、肺転移部位を採取し、培養して肺転移細胞株を樹立する。同様な手法を複数回行い、高肺転移株を作成することを検討している。高肺転移株を作成後は、マウスの脛骨へ同所性移植を行い、腫瘍モデルを作成することを計画している。また、現在A673を用いてGFPの形質導入を行っているが、他のEwing肉腫細胞株でもGFPの形質導入を行う予定である。複数のEwing肉腫細胞株にGFP導入を行い、高肺転移株を複数作成し、それぞれのマイクロRNA発現を確認することで、肺転移の機序を探索する。Ewing肉腫のキードラッグである薬剤（ドキソルビシン、イホマイドなど）を用いて、Ewing肉腫抗がん剤耐性株を作成している。こちらも、A673で作成を計画していたが、その他の細胞株も用いて、複数のEwing肉腫細胞株の抗がん剤耐性株を作成する事を計画している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Ewing肉腫細胞株を複数用いてGFP形質導入を行っているが、安定して発現されない細胞株があり、安定したGFPの発現を維持できるように調整している。また、Ewing肉腫細胞株の抗がん剤耐性株を作成中である。

Strategy for Future Research Activity

Ewing肉腫細胞株へのGFPの安定発現のため、セレクションの調整を行う。GFP発現を安定化させた後、マウスに移植して、肺転移株を作成する。肺転移株を複数回作成して高肺転移株を作成し、親株とのマイクロRNAなどの変化を確認する。Ewing肉腫細胞株の抗がん剤耐性株を作成後に、親株と耐性株のマイクロRNA発現の違いを確認する。候補となるマイクロRNAの発現を抑制して、同細胞株をマウスへ同所性移植し、腫瘍のマイクロRNAの発現の変化を確認する。