| Project/Area Number |
23K15721
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 56020:Orthopedics-related
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
下村 征史 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員講師 (50935393)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 軟骨肉腫 / ダイレクトリプログラミング / direct re-programming / direct re-programing / 軟骨 |
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| Outline of Research at the Start |
軟骨肉腫の治療は手術が原則であり，腫瘍広範切除術を行い，同部位を再建することが行われる．近年，再建方法の進歩により，液体窒素を用いた自家処理骨移植術が行われることが増えてきている．しかし，軟骨肉腫では処理を行う腫瘍骨が肉腫に侵されることで脆弱性を来たしていることが多く，処理骨移植術の成績が必ずしも良好ではなく，人工関節に頼ることが多い.本研究の目的は軟骨肉腫細胞を骨芽細胞へre-programmingし，手術加療時の骨強度を担保することである．軟骨肉腫細胞株に複数遺伝子を導入することにより，類骨形成を伴う骨芽細胞にre-programmingすることを目標とする．
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| Outline of Annual Research Achievements |
軟骨肉腫細胞株であるSW1353に対して骨芽細胞への分化を誘導する目的で、Runx2およびOsterixという転写因子遺伝子を導入する条件について検討を行った。本研究では、効果的な遺伝子導入を実現するために、使用するウイルスベクターの種類やウイルス液の最適量、細胞播種時の初期細胞数、さらには培養期間や添加培地成分の影響も系統的に評価した。
具体的には、レンチウイルスベクターを用いてRunx2およびOsterixをSW1353細胞に導入し、ウイルス液の希釈倍率やMOI（Multiplicity of Infection）を複数条件で設定して、遺伝子導入効率と細胞生存率とのバランスを検討した。また、細胞を播種する際の密度についても検討を加え、細胞同士の接触やコンフルエント状態が分化に与える影響も評価した。さらに、分化誘導培地の有無および培養期間によって、染色性および遺伝子発現の違いが生じるかどうかを比較検討した。
その結果、Runx2およびOsterixを同時に導入した細胞では、アリザリンレッド染色によって石灰化を示す赤色の沈着が明瞭に観察され、対照群と比較して差が認められた。染色結果に加えて、定量的な遺伝子発現解析も実施し、RT-PCR法により骨形成関連マーカーの発現変化を確認したところ、Runx2およびOsterixの発現が明瞭に認められたのに加えて、Osteocalcin、Osteopontin、Alkaline Phosphatase（ALP）といった典型的な骨芽細胞マーカー遺伝子の発現レベルも有意に上昇していた。
これらの結果から、SW1353細胞に対してRunx2およびOsterix遺伝子を導入することによって、軟骨肉腫細胞が骨芽細胞様の表現型を獲得し、骨形成に関連する分子の発現や機能的変化が誘導されることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
in vitroの実験でのデータがそろいつつあり、ダイレクトリプログラミングの手技で軟骨肉腫細胞から骨芽細胞様細胞へ分化させる可能性が示されつつある。in vivoの実験への移行も問題なく可能と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は細胞増殖能を評価する予定である。またRNA-seqを行い、遺伝子発現の変化を網羅的に調査する。
in vivoの実験では、ヌードマウスを用いて皮下モデルを作成し、腫瘍の増大について評価する。
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