| Project/Area Number |
23K15768
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 56030:Urology-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
田中 勇太朗 大阪大学, 大学院工学研究科, 助教 (70813434)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2024: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | 尿路結石 / カルシウム結合タンパク質 / 多重イメージング解析 / 隕石学 / 鉱物学 / 結晶成長 / タンパク質 |
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| Outline of Research at the Start |
わが国における尿路結石の生涯罹患率は12％にまで増加し、5年再発率は50％に及ぶ。しかし、現在有効な再発予防薬はない。尿路結石予防の創薬のためには、その成長メカニズムの解明が必要不可欠である。尿路結石に僅かに含まれるタンパク質は、その成長過程に大きく影響を及ぼす。私たちは、鉱物学・隕石学の分析技術を応用し、結石内の微細構造に対して複数のタンパク質を同時に可視化することに成功した。本研究では、これまでの分析手法を発展させ、以下の2段階で研究を行い、結石成長に及ぼすタンパク質の詳細な機能を解明する。この成果により、尿路結石成長メカニズムの解明および新規予防法の創出を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、鉱物学・隕石学の分析技術を応用した結石内の微細構造に対して複数のタンパク質を同時に可視化する技術で、尿路結石に含まれるCalcium Binding Proteinの結石成長に及ぼす詳細な機能を解明することを目的としている。2023年度～2024年度にかけて、まずは複数の結石サンプルから内部構造の詳細な分析を可能とする薄片を作成した。まず【研究１】として、薄片を用いてマイクロCT、偏光顕微鏡観察、さらに顕微フーリエ変換赤外分光分析およびラマン分光分析を行い、結石を構成する無機成分の構造・分布解析を行った。【研究１】で分析を行った試料に対して、【研究２】として標的Calcium Binding Proteinに対する多重免疫染色・SEM解析を行い、有機成分の構造・分布解析を行った。今回ターゲットとしたタンパク質は、Calcium Binding Domainといった特有のアミノ酸配列をもち、その配列や構造の違いに応じて局在が異なることを見出した。また、Calcium-binding protein以外の微量タンパク質は、結石内に取り込まれないことも明らかにした。
さらに我々は、なぜCalcium Binding Proteinは結晶内部に取り込まれ特徴的な分布を示すのかという学術的な問いついて研究を進めている。【研究1】【研究２】で得られた結果から、タンパク質が結晶に取り込まれる要因として、Calcium Binding Domainに対応した結合できるカルシウムの数が重要であることが分かった。さらに、タンパク質と結晶面との付着には結晶面がもつ原子配列とCalcium Binding Domainの構造との親和性が重要であることも分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
手術で回収したシュウ酸カルシウム結石から薄片（N=7）を作製した。その薄片を用いて、無機成分（一水和物（COM）二水和物（COD））に対する構造解析として、偏光顕微鏡およびラマン分光分析を行った。さらに有機成分に対するイメージング解析として、8種類のCalcium-binding protein（OPN、RPTF-1、Cal-A、Albumin、THP、HMBG、Protein Z）、そしてnon Calcium-binding protein（Lysozyme）をターゲットに多重免疫染色を行った。無機成分の構造解析の結果から、結石を構成する無機成分の結晶を、菱形構造COD、不均一構造COM、層構造COMの3つに分類した。有機成分のイメージング解析結果から、菱形構造COD結晶ではOPN、HMBG、RPTF-1、Protein Zは結晶内部に局在し、OPN、HMBGはCOD結晶面｛110｝に、RPTF-1、Protein Zは｛101｝に偏在しやすい傾向にあった。一方、Cal-A、Albumin、THPは結晶表面、Lysozymeは結晶外に局在していた。層構造COMでは、OPN、HMGB、RPTF-1、Protein Zが均一な間隔で層状に、それ以外のタンパク質は不均一な間隔で層状に局在していた。今回新たな分析技術を応用したことで、結石を構成する結晶において8つタンパクの局在の違いを明らかにした。結晶内部であったOPN、HMBG、RPTF-1、Protein Zは、そのCalcium Binding Siteのアミノ酸と結晶面の原子配列との高い親和性によって、特異的に結晶面に付着し結晶内部に取り込まれことがわかった。一方、結晶表面であったCal-A、Albumin、THP は、結晶面との低い親和性によって、非特異的に結晶表面に付着し結晶内部に取り込まれないことがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、尿路結石を構成するタンパク質の網羅的な二次元・三次元的イメージング解析を引き続き行っていく予定である。尿路結石に含まれるタンパク質は100種類以上同定されている。そのうち、カルシウムを多く含む結晶に付着しやすいドメインをもつタンパク質（Calcium-binging protein）はこれまで分析したOPN、RPTF-1、Cal-Aを含め約20種類存在する。まずは、これまで分析できていないタンパク質（Glis2, CalB, Bikunin etc）をターゲットに解析を進め、より精度を高めていく予定である。さらに、Calcium-binding protein以外の微量タンパク質に対しては、液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）分析を応用したイメージング解析を行う予定である。しかし、結石からタンパク質を精度よく抽出することが難しい課題であり、その前段階としてヒトの尿を用いてタンパク質の抽出を試みている。具体的には尿をフィルターろ過、透析、カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、その後Ｗestern blottingや二次元電気泳動を行い、タンパク質を分離している。その手法が確立できた段階で、実際の結石からタンパク質の抽出を行いLC-MSを用いたイメージング解析を行う予定である。
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