| Project/Area Number |
23K16034
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 57040:Regenerative dentistry and dental engineering-related
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
大堀 悠美 東北大学, 歯学研究科, 助教 (70908441)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | 間葉系幹細胞（MSC） / 神経堤幹細胞 / 三次元培養 / 骨再生 / 間葉系幹細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
近年，高い増殖能と多分化能から間葉系幹細胞(MSC)が骨再生の細胞源として臨床応用されている．しかしながら，骨再生療法の一部で治療成績が不十分な症例も存在しており，効率的な骨再生の実現が重要な課題となっている．申請者はこれまでに，振盪培養法を用いて骨髄MSCから神経堤様MSC細胞塊(スフェア)を作製し，骨再生を促進させることに成功している．本研究では，神経堤由来細胞をトレースできるトランスジェニックマウスから神経堤由来とそれ以外のMSCを採取しスフェアを作製することで，スフェアを構成する骨髄細胞の発生由来を解明し，骨再生促進のメカニズムを解明する一助とする．
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| Outline of Annual Research Achievements |
間葉系幹細胞(MSC)は幹細胞療法の細胞源として，治療が困難であった大規模な骨欠損に対しても良好な治療成績をもたらすことが期待されている．しかしながらMSCは採取部位によってその性質が異なり，神経堤から発生する頭頚部骨髄MSCのほうが中胚葉から発生する体幹部骨髄MSCより骨分化能・骨再生能が高いことが報告されていることから，神経堤由来MSCが骨再生に有利な細胞であることが示唆されている．申請者は骨髄MSCを一定条件下で浮遊培養することにより神経堤様の性質を有する神経堤様MSC細胞塊(スフェア)を形成し，骨再生を促進させることに成功した．これより，MSCの神経堤様の性質が骨再生能の向上に寄与するとの仮説を立てた．本研究では，神経堤由来細胞をトレース可能なP0-cre/CAG-CAT-EGFPマウス骨髄から神経堤由来P0陽性MSCとそれ以外のP0陰性MSCを用いてスフェア形成を行い，スフェアを構成する骨髄細胞の発生由来を解明し，骨再生促進のメカニズムを検討することを目的とした．P0-cre/CAG-CAT-EGFPマウス骨髄よりFACSを用いた細胞分取を行ったところ，P0陽性細胞は骨髄細胞の0.1%以下しか含まれず，これらの細胞からスフェア形成を試みたところ，セルラインと同様の条件下での培養ではスフェア形成は認められなかった．その要因として，採取してきたプライマリー細胞はセルラインと比較してヘテロな細胞集団であり，本実験で使用した動的条件下の浮遊培養は，均一でない細胞で細胞間接着が重要となるスフェア形成が困難であったことが考えられる．そこで静的条件下でのスフェア形成を試みたところ，プライマリー細胞でもスフェアが形成された．今後，静的あるいは動的条件がスフェア構成細胞に与える影響を検討し，形成された神経堤由来P0陽性MSCスフェアが骨再生能に与える影響を解析していく予定である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本実験ではP0-cre/CAG-CAT-EGFPマウス骨髄から分取したプライマリーMSCの培養を試みたが，過去に骨再生促進効果が認められたセルラインから形成した神経堤様MSCスフェアと同様の方法でのスフェア形成が困難であった．神経堤様MSCスフェア形成は動的条件下での浮遊培養を行っていたが，よりヘテロな細胞集団であるプライマリーMSCに対する機械的刺激はスフェア形成を阻害することが考えられた．そこで静的条件でプライマリーMSCのスフェア形成を試みたところ，3次元的なスフェアの形成は成功した．当初の研究計画に加えて，浮遊培養における静的あるいは動的条件がスフェア構成細胞に与える影響を明らかにする追加実験が必要になったが，本研究課題はおおむね順調に進展している．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究実施計画では，①静的あるいは動的条件がMSCスフェア構成細胞に与える影響を検討すること，②神経堤様MSCスフェアを構成する細胞集団の発生由来の違いを検証すること，③神経堤由来MSCとそれ以外のMSCから作製した神経堤様MSCスフェアの骨再生能の違いを明らかにする．
まず，①静的あるいは動的条件がMSCスフェア構成細胞に与える影響を検討する．これはセルラインMSCを用いることで，従来の動的条件下で形成した神経堤様MSCスフェアと，プライマリーMSCからもスフェア形成可能な静的条件下で形成したMSCスフェアの性質，特に骨再生能への影響を検討する．
次に，②神経堤様MSCスフェアを構成する細胞集団の発生由来の違いを検証する．神経堤由来細胞を永続的にトレース可能なP0-cre/CAG-CAT/EGFPマウス骨髄からMSCを分取し，浮遊培養にてスフェアを形成する．神経堤由来P0陽性MSCとそれ以外のP0陰性MSCがスフェア内でどのように増殖し配列するかを解析することで，スフェアの幹細胞性が向上するメカニズムを細胞発生起源の観点から検証を試みる．
最後に③神経堤由来MSCとそれ以外のMSCから作製した神経堤様MSCスフェアの骨再生能の違いを明らかにする．頭頚部骨欠損への自家骨移植では，同じ頭頚部骨（神経堤由来）のほうが四肢骨（中胚葉由来）の移植より治療生成期が良いことが明らかとなっていることからも，骨再生において生体発生を考慮する重要性が示唆されている．当研究グループは頭蓋骨あるいは大腿骨欠損モデルによる骨形成評価法を確立している．そこでP0陽性・P0陰性MSCスフェアをそれぞれ頭蓋骨あるいは大腿骨欠損モデルへと移植することで，MSCの発生由来が骨再生に与える影響を検証する．
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