Challenge to elucidation of pathology based on the discovery of protein pyrrolation

• Project/Area Number: 23K17374
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 内田 浩二 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (40203533)
• Project Period (FY): 2023-06-30 – 2028-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000); Fiscal Year 2027: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2026: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2025: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2024: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2023: ¥10,400,000 (Direct Cost: ¥8,000,000、Indirect Cost: ¥2,400,000)
• Keywords: タンパク質ピロール化 / ピロールリジン / 抗DNA抗体 / ファージディスプレイ / 自己免疫疾患

Outline of Research at the Start

加齢や疾病などに伴うタンパク質の化学修飾は避けられない生命現象である。最近発見された“リジンピロール化”により、タンパク質は抗DNA抗体や核酸染色試薬などにより認識される。タンパク質がこうしたDNA様構造特性を示す現象は、ピロール化以外には知られていない。また、抗DNA抗体との親和性から全身性エリテマトーデス (SLE)などの難病との関連性が示唆されており、健康や疾病など、生命現象における何らかの関与が示唆される。この新規性・独創性に溢れたタンパク質ピロール化研究をさらに加速させることにより、生体内におけるタンパク質の化学修飾が及ぼす新たな疾患病態の分子機序解明に繋がるものと期待される。

Outline of Annual Research Achievements

・新規ピロール化因子の同定：リジン残基をピロール-L-リジン (pyrK) に変換するタンパク質ピロール化は、脂質過酸化反応を介して発生する非酵素的共有結合修飾と考えられてきたが、タンパク質を金属/アスコルビン酸と反応させてもpyrKの生成が見られた。さらに、金属触媒によるアスコルビン酸の酸化的分解反応により、ピロール化因子としてグリコールアルデヒド及びグリオキサールが同定された。これらの結果は、脂質過酸化と同様に還元糖の自動酸化が自己抗原性ピロール化の原因となりうることを示唆した。
・ピロール化タンパク質を認識する多重交差性抗体の解析：自己免疫疾患の一種である全身性エリテマトーデス（SLE）では抗DNA抗体の異常産生が見られる。こうした抗DNA抗体が翻訳後修飾タンパク質であるピロール化タンパク質にも特異性を示すことを明らかにしてきたが、これまで抗DNA抗体が非核酸分子であるピロール化タンパク質を認識するメカニズムは不明であった。そこで、ファージディスプレイ法を用いてピロール化タンパク質を認識する抗体フラグメントを複数作製し、抗体重鎖可変領域（VH）が抗原認識を担うことを発見した。特に抗原と結合する領域である相補性決定領域（CDR）に存在するArg残基の重要性を示した。また、VHが認識するピロール化タンパク質中の構造として、ピロールリジンと酸性アミノ酸を複数含むペプチド配列を同定した。これらの結果から、正に帯電した抗DNA抗体のVHが、負に帯電したピロール化タンパク質と静電的に相互作用していることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

金属触媒によるアスコルビン酸の酸化的分解反応により、ピロール化因子としてグリコールアルデヒド及びグリオキサールを同定することに成功した。また、ピロール化タンパク質を認識する多重交差性抗DNA抗体に関しては、ファージディスプレイ法を用い、ピロール化タンパク質を認識する抗体フラグメントを複数作製することに成功し、抗体重鎖可変領域（VH）が抗原認識を担うことを発見した。さらに、VHが認識するピロール化タンパク質中の構造として、ピロールリジンと酸性アミノ酸を複数含むペプチド配列を同定することに成功した (Anan et al., Commun. Biol., 2024)。

Strategy for Future Research Activity

・新規ピロール化因子の同定：付加体の網羅的解析法であるアダクトーム法を用い、細胞内におけるピロール化タンパク質の解析を行う。
・ピロール化タンパク質を認識する多重交差性抗体の解析：前年度までの成果として、ピロール化タンパク質に対してアフィニティを示す一本鎖可変領域抗体 (scFv)は、抗体重鎖可変領域（VH）が抗原認識を担うことを見出した。今年度は、VHに関し、さらにX線結晶解析を行い、抗体-抗原結合機構を解明する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] 梨花女子大学(韓国)
• [Int'l Joint Research] ミラノ大学(イタリア)
• [Int'l Joint Research] パデュー大学(米国)
• [Journal Article] Molecular and structural basis of anti-DNA antibody specificity for pyrrolated proteins (2024)
  • Author(s): Anan Yusuke、Itakura Masanori、Shimoda Tatsuya、Yamaguchi Kosuke、Lu Peng、Nagata Koji、Dong Jinhua、Ueda Hiroshi、Uchida Koji
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 7 Issue: 1
  • DOI: 10.1038/s42003-024-05851-0
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Neuritogenic steroid glycosides from crown-of-thorns starfish: Possible involvement of p38 mitogen-activated protein kinase and attenuation of cognitive impairment in senescence-accelerated mice (SAMP8) by peripheral administration. (2023)
  • Author(s): Sasayama Y, Mamiya T, Qi J, Shibata T, Uchida K, Nabeshima T, Ojika M.
  • Journal Title: Bioorg Med Chem Volume: 78 Pages: 117144-117144
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2022.117144
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Pivotal role for S-nitrosylation of DNA methyltransferase 3B in epigenetic regulation of tumorigenesis (2023)
  • Author(s): Okuda, K. et al.,
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 14 Issue: 1 Pages: 621-621
  • DOI: 10.1038/s41467-023-36232-6
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Eriodictyol and thymonin act as GPR35 agonists (2023)
  • Author(s): Nakashima Fumie、Qi Loh Wei、Wakabayashi Mayuka、Shimomura Sayako、Hattori Hiroyuki、Kita Masaki、Inoue Asuka、Uchida Koji、Shibata Takahiro
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Volume: 87 Issue: 12 Pages: 1514-1522
  • DOI: 10.1093/bbb/zbad125
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 自己免疫疾患において観察されたリジンモノメチル化の特異的変化 (2024)
  • Author(s): 山口 公輔、内田 浩二
  • Organizer: 日本農芸化学会 2024年度大会
• [Presentation] 免疫細胞のフェロトーシスにおけるアクロレインの関与 (2024)
  • Author(s): 川尻 海斗、糸井 海星、内田 浩二
  • Organizer: 日本農芸化学会 2024年度大会
• [Presentation] 自己免疫疾患における交差性IgE抗体の解析 (2024)
  • Author(s): 藤田 夏歩子、中村 亘希、阿南 優佑、板倉 正典、内田 浩二
  • Organizer: 日本農芸化学会 2024年度大会
• [Presentation] 抗酸化剤に起因する修飾シグネチャーの構造と機能 (2023)
  • Author(s): 内田 浩二
  • Organizer: 第76回日本酸化ストレス学会学術集会 シンポジウム1 農学系研究者と医学系研究者からの発信～連携に向けて～
  • Invited
• [Presentation] 酸化に起因した修飾シグネチャーの構造と機能 (2023)
  • Author(s): 内田 浩二
  • Organizer: 第50回日本毒性学会学術年会 シンポジウム 化学物質のアダクト形成を介した新規毒性機構の解明とその検出
  • Invited
• [Presentation] 特別講演 付加体発掘40年 (2023)
  • Author(s): 内田 浩二
  • Organizer: 日本毒性学会付加体科学部会第１回キックオフシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 短寿命活性種に起因する付加体の構造と機能 (2023)
  • Author(s): 内田 浩二
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会 シンポジウム 付加体科学とは何か
  • Invited
• [Presentation] シンポジウム レドックスシグネチャーの生物学 イントロダクション (2023)
  • Author(s): 内田 浩二
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] Oxidatively modified proteins as sources of innate immune responses (2023)
  • Author(s): Koji Uchida
  • Organizer: 韓国フリーラジカル学会2023シンポジウム
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 全身性エリテマトーデスにおける抗DNA IgE抗体の解析 (2023)
  • Author(s): 藤田 夏歩子, 中村 亘希, 阿南 優佑, 板倉 正典, 内田 浩二
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] ポリフェノールによるタンパク質修飾を介した自然免疫の調節 (2023)
  • Author(s): 畠山 千晴, 山口 公輔, 遠藤 龍之助, 板倉 正典, 内田 浩二
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] ファージディスプレイ法を用いた自己免疫疾患における抗好中球抗体の解析 (2023)
  • Author(s): 塚本 萌南, 阿南 優佑, 板倉 正典, 内田 浩二
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] マクロファージによるapoE受容体を介したピロール化タンパク質の取り込み (2023)
  • Author(s): 岡本 麻央、板倉 正典、内田 浩二
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] 細胞内ピロール化タンパク質の解析 (2023)
  • Author(s): 山口 公輔、板倉 正典、内田 浩二
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] 細胞内ピロール化タンパク質の解析 (2023)
  • Author(s): 山口 公輔、板倉 正典、内田 浩二
  • Organizer: 日本毒性学会 付加体科学部会 第１回キックオフシンポジウム
• [Remarks] 東京大学大学院農学生命科学研究科食糧化学研究室HP
  • URL: https://park.itc.u-tokyo.ac.jp/foodchem/publications.html