自由行動動物の深部臓器における細胞応答の光イメージング

• Project/Area Number: 23K17389
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 口丸 高弘 自治医科大学, 医学部, 准教授 (10570591)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩野 智 宮崎大学, キャリアマネジメント推進機構, 講師 (10734832) ; 花岡 健二郎 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (70451854) ; 古田 忠臣 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (10431834)
• Project Period (FY): 2023-06-30 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000); Fiscal Year 2025: ¥7,800,000 (Direct Cost: ¥6,000,000、Indirect Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2024: ¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2023: ¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000)
• Keywords: 近赤外生物発光 / 自由行動動物 / 発光分子センサ / 代謝 / 細胞機能 / 発光センサ

Outline of Research at the Start

本研究課題では、近赤外生物発光源を用いて、自由行動する動物の深部臓器における細胞応答の非侵襲的かつ定量的光イメージング技術の開拓に挑む。真に生理的な状態にある自由行動動物の生体組織機能を特徴づける細胞応答のリアルタイム解析が叶えば、運動、睡眠や社交行動など自由行動を伴う生命活動の理解にむけて非常に強力なアプローチになるだろう。その実現のために、これまでに両立が困難であった長波長・高輝度でありながら定量性に優れた近赤外発光分子センサの設計手法を確立する。そして、開発した近赤外発光センサを、マウスの全身臓器を対象とした生理・疾患応答研究に実装する。

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、AlfaBCの分子設計の最適を進めた。具体的には、ATP結合ドメインに接続するAkalucとHalotagの末端を削り取ることで、発光エネルギー共鳴エネルギー移動 (BRET)効率が改善することを確認した。さらに、マウス生体組織におけるHalotagの近赤外色素標識の条件検討を実施した。そのために、アデノ随伴ウィルス9(AAV9)に、ATP非応答型のBRET発光源(Akaluc-AB-Halotag)を搭載し、マウスの臓器(心臓・肝臓・筋肉)に遺伝子導入を試みた。この時、AAVへの搭載遺伝子サイズを最大化する目的で、100-800 塩基程度のサイズにまたがる複数のプロモーターによる発光レポーターの発現効率についてマウスにて比較したが、広く普及しているmCAGプロモーターに匹敵するような発現量を示す小型プロモーターは得られなかった。100 塩基程度の小型プロモーターによる発光レポーターの肝組織での発現量は、mGAGよりも二桁近く低かった。そこで、AAV9-mCAGにAkaluc-AB-Halotagを搭載し、マウスに尾静脈投与することで、マウスの内蔵にBRET発光源を発現させた。そして、Halotag ligand-SiR680 (HL-SiR680)を全身投与した後、Akaluc-AB-Halotagの蛍光標識効率を発光波長のシフト(BRET効率)から解析した。その結果、投与後15分程度でBRET効率はピーク値をとり、その後30-60分にわたってピーク値が一定に保たれることなどが明らかになった。また、BRET効率は、培養細胞で得られる値とほぼ一致しており、マウスの臓器内でもHalotagの蛍光色素標識反応がほぼ飽和していることも確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究分担者との連携も順調であり、生体組織におけるHalotagの蛍光色素標識のために十分な色素を確保し、実験を実施することができた。

Strategy for Future Research Activity

研究を推進する上で1つの大きなハードルであった生体組織におけるHalotagの蛍光色素標識において、ほぼ想定通りの結果が得られたことで、今後もプロジェクトが滞りなく推進できる状況にある。一方、mCAGに変わるプロモーターの探索は今後も継続する必要がある。