| Project/Area Number |
23K17397
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
山本 雄介 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, ユニット長 (60768117)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮本 崇史 筑波大学, 医学医療系, 助教 (50740346)
増田 正人 東洋大学, 総合情報学部, 准教授 (60708543)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000)
Fiscal Year 2026: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
Fiscal Year 2025: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
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| Keywords | エクソソーム / ライブセルイメージング / 分泌機構 |
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| Outline of Research at the Start |
標的細胞に取り込まれたエクソソームが、どのような挙動を示すことで情報伝達を達成しているのかは、未だ解明されていない。従って、取り込まれたエクソソームの動態と内容物が標的細胞内に与える影響との関係性を詳細に紐付けることが求められている。申請者らは、長期生細胞観察用の外部アポダイズド位相差顕微鏡法によるラベルフリーイメージングで、エクソソームの高速かつ長期連続撮影を行い、その挙動を詳細に追跡することにした。これにより、これまで誰も知り得なかった『標的細胞内におけるエクソソームの挙動』と、エクソソームが『いつ・どこで・どのようにして標的細胞内の情報を伝達するのか』を理解することを目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
正常細胞ならびにがん細胞の培養上清からエクソソームを回収し、それらを添加した受け手の細胞内でのエクソソームの軌跡・動態を解析する。それらの定量的なデータを蓄積し解析することを基盤技術とする。実際には、様々な種類のがん細胞や培養環境の異なる細胞から超遠心法によって回収したエクソソームをExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kitで染色したあとに、異なる組織由来の細胞株に添加することで、その動態を外部アポダイズド位相差顕微鏡法(ExAPC)と蛍光顕微鏡法によるTime-lapse imagingで解析する。予備検討ならびに本年度の解析によって、ExAPCによって、蛍光ラベルをせずに生細胞においてエクソソームと推測される小胞の動きを確認できている。蛍光ラベルしたエクソソームの添加実験を行うことで追加確認を行う。撮影はエクソソームの追跡が可能な1～50 frame per second (FPS)で行い、エクソソームの標的細胞内における動態を詳細な空間情報に基づいて解析し、データの蓄積を進めている。また、ヒト間葉系幹細胞や、乳がん細胞株MCF7のエクソソームを超遠心法で単離し、small RNA-seq解析によって内包されているマイクロRNAプロファイルの作成を行った。さらに、エクソソームの分泌量を遺伝子操作によって制御する方法の開発の成功しており、エクソソームの分泌量が低下した細胞と分泌量が増加している細胞を作製した。これらの遺伝子操作を行った細胞を用いて、エクソソームの追跡を行うことで、エクソソームの量が細胞内でのエクソソームの動態に与える影響を解析する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の検討では、ExAPCによって、蛍光ラベルをせずに生細胞においてエクソソームと推測される小胞の動きを確認できている。蛍光ラベルしたエクソソームの添加実験を行うことで追加確認を行う。撮影はエクソソームの追跡が可能な1～50 frame per second (FPS)で行い、エクソソームの標的細胞内における動態を詳細な空間情報に基づいて解析し、データの蓄積を進めている。添加予定のエクソソームの内包物の解析も進めており、血清を無添加の状態で培養したヒト間葉系幹細胞ならびに、乳がん細胞株であるMCF7細胞から超遠心法によって回収したエクソソームのマイクロRNAの発現データを取得した。さらに、今後の画像解析で使用するエクソソーム分泌量を人工的に増加されたMCF7細胞と減少させたMCF7細胞の樹立に成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度作成したエクソソーム分泌量を人工的に増加・減少させたMCF7細胞と親株のMCF7細胞を用いて、ExAPCならびに蛍光顕微鏡法によるTime-lapse imaging解析を行う。それによって、細胞内でのエクソソームの軌跡を明らかにする。細胞の種類や条件を変えてデータを蓄積していく。さらに、エクソソームの内包物のデータも併せて取得していき、エクソソームの動態データと内包物のデータを併せて取得する。
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