３次元空間の１細胞光遺伝学の創成

• Project/Area Number: 23K17405
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 45:Biology at organismal to population levels and anthropology, and related fields
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 杉 拓磨 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (70571305)
• Project Period (FY): 2023-06-30 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥25,870,000 (Direct Cost: ¥19,900,000、Indirect Cost: ¥5,970,000); Fiscal Year 2026: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000); Fiscal Year 2025: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2024: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2023: ¥12,350,000 (Direct Cost: ¥9,500,000、Indirect Cost: ¥2,850,000)
• Keywords: 光遺伝学 / ライトフィールド光学系 / マウス / 大脳皮質L2/L3

Outline of Research at the Start

現在、神経細胞集団内で「どこの細胞がどの順番で活性化するのか」という活性化の時空間パターンの違いが情報処理や記憶の変化をもたらす可能性が示唆されている。この可能性を検証し、記憶等を規定する時空間パターンを明確にする方法の１つは、イメージングで活性化の場所と順番を①高速計測し、その順番通りに神経細胞を②1つずつ光照射して人為的に再活性化させ、記憶や行動が再現されるか検証することである。本研究では独自の①計測技術と②光照射技術を統合してシングルセル３Ｄオプトジェネティクス技術を開発し、マウスの大脳皮質L2/L3の解析に応用することで有用性を実証する。

Outline of Annual Research Achievements

シングルセルレベルの活性操作のためには、3D空間の全細胞の位置情報を高速に抽出して追跡する1計測技術とその位置情報から特定の細胞だけを標的にした2光照射技術が必要である。計測技術については、高分解能ライトフィールド顕微鏡において、三次元像を再構成せずに、単純な計算式をもとに二次元画像から直接、各粒子の三次元座標抽出を可能にした。さらに次のステップとして、毎秒1,000フレームで二次元ライトフィールド画像を得ながら、撮影時刻t 秒とその次の撮影時刻t + 0.001秒で得た画像の間で同一の細胞同士をマッチングさせるプログラムをMATLAB上で作製することに成功した。さらに、このプログラムをPythonへポーティングすることで、高速化することが可能となった。実証実験には、まず0.5 μmの蛍光粒子を3D空間に固定した試料を用いた。その後、蛍光粒子を浮遊させた溶液で、「動く粒子」のリアルタイム追跡を行った。通常、神経活性の計測では、神経活性とカルシウム流入に相関があることからカルシウムインディケーターGCaMPの蛍光輝度変化をモニターする。そこで、異なる蛍光輝度をもつ蛍光粒子を分散させ、GCaMPと同レベルの一定以上の蛍光輝度を持つ粒子の位置情報と輝度の抽出を行い、一定以上の活性を持つ細胞をリアルタイムに抽出できるようにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

3D空間の全細胞の位置情報を高速に抽出して追跡する技術を構築したため。・

Strategy for Future Research Activity

デジタルミラーデバイスを用い、3D空間の特定の座標にのみ、5 μm分 解能で光照射する光学系を構築し、この光学系と令和５年度の技術を統合し、令和５年度の技術で得た位置座標からフィードバックをかけ、それらの座標にのみ光照射するプログラムを作成する

Research Products

• [Journal Article] The Large-Scale Cultivation of Nematodes to Study Their Collective Behaviors (2023)
  • Author(s): Imamura Ryuki、Nakane Yurina、Jiajing Hu、Ito Hiroshi、Sugi Takuma
  • Journal Title: Journal of Visualized Experiments Volume: 1 Issue: 198 Pages: 10-10
  • DOI: 10.3791/65569
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Caenorhabditis elegans transfers across a gap under an electric field as dispersal behavior (2023)
  • Author(s): Chiba Takuya、Okumura Etsuko、Nishigami Yukinori、Nakagaki Toshiyuki、Sugi Takuma、Sato Katsuhiko
  • Journal Title: Current Biology Volume: 33 Issue: 13 Pages: 2668-2677.e3
  • DOI: 10.1016/j.cub.2023.05.042
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Development of 4D light-field microscopy for understanding statistical physics dynamics (2023)
  • Author(s): Ryuki Imamura, Shin Usuki, Takuma Sugi
  • Organizer: 28th International Conference on Statistical Physics, STATPHYS28
• [Presentation] Development of real-time 3D multi-particle tracking by high-resolution light-field microscopy (2023)
  • Author(s): 今村 隆輝, 臼杵 深, 杉 拓磨
  • Organizer: 第61回日本生物物理学会年会
• [Presentation] In vivo 3D thermometry / 生体内3D温度計測技術の開発と応用 (2023)
  • Author(s): 中根有梨奈、前岡 遥花、五十嵐 龍治、臼杵 深、杉 拓磨
  • Organizer: 第61回日本生物物理学会年会
• [Presentation] 高分解能ライトフィールド顕微鏡の開発と生体機能計測への応用 (2023)
  • Author(s): 今村 隆輝, 臼杵 深, 片岡 直也, 杉 拓磨
  • Organizer: 第71回応用物理学会春季学術講演会
• [Presentation] シングルセル3 Dオプトジェネティクス技術の開発と応用 / Development and application of single-cell 3D optogenetics technology (2023)
  • Author(s): 井上 智好, 今村 隆輝, 臼杵 深, 片岡 直也, 杉 拓磨
  • Organizer: 第71回応用物理学会春季学術講演会
• [Patent(Industrial Property Rights)] ライトフィールド三次元トラッキング制御装置、方法およびプログラムならびにライトフィールド顕微鏡システム (2024)
  • Inventor(s): 杉 拓磨、今村 隆輝、広瀬 真里枝、前岡 遥花、臼杵 深
  • Industrial Property Rights Holder: 杉 拓磨、今村 隆輝、広瀬 真里枝、前岡 遥花、臼杵 深
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2024-025750
  • Filing Date: 2024
• [Patent(Industrial Property Rights)] 選択照射制御装置、選択照射制御方法およびプログラムならびに選択照射システム (2023)
  • Inventor(s): 杉 拓磨、井上 智好、今村 隆輝、広瀬 真里枝、臼杵 深
  • Industrial Property Rights Holder: 杉 拓磨、井上 智好、今村 隆輝、広瀬 真里枝、臼杵 深
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2023-198583
  • Filing Date: 2023