複雑修飾中分子の固相化学酵素合成

• Project/Area Number: 23K17410
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 47:Pharmaceutical sciences and related fields
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 松田 研一 北海道大学, 薬学研究院, 講師 (50812301)
• Project Period (FY): 2023-06-30 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000); Fiscal Year 2026: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2025: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2024: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2023: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
• Keywords: 生体触媒 / 中分子 / 天然物 / 生合成 / 化学酵素合成 / 固相合成 / ポリケチド / ペプチド

Outline of Research at the Start

ポリケチドやポリケチド－ペプチドハイブリッド化合物は、医薬資源として重要な中分子群である一方で、非常に複雑な化学構造のため、これらを合成するための統一的な手法はありません。本研究では、高度な分子認識能をもつ生体触媒を活用し、これらの複雑中分子を固相上で構築するための汎用的な合成技術の開発を目指します。加えて、構築した炭素鎖の多様性をさらに拡張するための修飾技術の開発を目指します。

Outline of Annual Research Achievements

ポリケチドやポリケチド－ペプチドハイブリッド化合物は、医薬資源として重要な中分子群である一方で、非常に複雑な化学構造のため、これらを合成するための統一的な手法は確立されていない。本研究は、高度な分子認識能を有する生体触媒を活用し、ポリケチド骨格を固相上で合成する統一的な方法論を開発するとともに、合成したポリケチド鎖を天然物に匹敵する複雑さをもつハイブリッド中分子へと昇華するための多段階生体触媒フロー合成系の構築を目指す。本年度は主に、鎖状骨格構築後の構造多様化段階に関する検証を重点的に進めた。具体的には、酵素触媒の固定化法を検証し、新たな方法で固相に固定化した酵素触媒による分子変換が可能であることを示した。また多様化段階に用いる酵素触媒のレパートリーを拡充した。環化酵素についてはファミリー全体での網羅的な検証を進めており、詳細な検証を行ったものについては各々の基質選択性の差異が明らかになった。アルキル化酵素については、既存のものよりも基質選択性が大幅に寛容なものが複数得られた。今後、これらの選択性をさらに詳細に解析することで、基質毎に最適な酵素触媒を選択できる体制の構築を目指す。またポリケチドユニット合成にむけてC-C結合形成酵素触媒の開発を進める。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、鎖状分子の効率的に構造多様化する生体触媒フロー合成法を開発するため、酵素触媒の固定化法を検討した。まず組換えタンパク質を発現後に直接固相へする方法を検討した。その結果、非共有結合性の相互作用により、組換え酵素を固相に位置選択的に固定化できることを確認した。次に固定化した酵素触媒が活性を示すか検証した。ペプチド環化酵素PBP-type TEを固相に担持し、脱離基を付与した直鎖ペプチド基質と混合したところ、環化反応が効率よく進行した。以上により簡便な固定化酵素触媒の調製法を確立した。
また、本年度は鎖状基質の構造多様化のための酵素触媒を探索した。具体的には、ペプチド環化酵素PBP-type TEと、ペプチドアルキル化酵素PTについて、それぞれのタンパク質ファミリー全体で系統解析を行い、これらを異なる基質特異性をもつと予想されるサブグループに分類した。環化酵素については、サブグループから代表的な配列を選抜し、組換え酵素の活性を簡便なin vitro試験によって評価した。その結果、複数の組換え酵素にて環化活性が確認された。今後より詳細な解析を進める予定である。ペプチドアルキル化酵素については、アルギニンビスプレニル化酵素のサブクレードに着目し、組換え酵素の調製と機能解析を進めた。その結果、既存のAgcFよりも基質選択性が大幅に寛容であり、様々な鎖状・環状ペプチドのビスブレにル化を触媒可能なものが複数得られた。

Strategy for Future Research Activity

次年度以降は、未着手の生体触媒を用いたC-C結合形成反応の開発に着手する。これに向けてC-C結合形成反応を触媒するケトシンターゼやアルドラーゼ等の酵素ファミリーを対象に、配列探索と組換え酵素の機能解析を行う。また環化酵素については、各ホモログ酵素の機能解析を継続し、それぞれの基質選択性の差異を明らかにする。これにより、基質毎に最適な酵素触媒を選択できる体制の構築を目指す。

Research Products

• [Journal Article] Chemoenzymatic tandem cyclization for the facile synthesis of bicyclic peptides (2024)
  • Author(s): Kobayashi Masakazu、Onozawa Naho、Matsuda Kenichi、Wakimoto Toshiyuki
  • Journal Title: Communications Chemistry Volume: 7 Issue: 1 Pages: 67-67
  • DOI: 10.1038/s42004-024-01147-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Bacterial Hydrazine Biosynthetic Pathways Featuring Cupin/Methionyl tRNA Synthetase‐like Enzymes (2024)
  • Author(s): Matsuda Kenichi、Wakimoto Toshiyuki
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: - Issue: 9
  • DOI: 10.1002/cbic.202300874
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phylogeny‐guided Characterization of Bacterial Hydrazine Biosynthesis Mediated by Cupin/methionyl tRNA Synthetase‐like Enzymes (2024)
  • Author(s): Matsuda Kenichi、Nakahara Yuto、Choirunnisa Atina Rizkiya、Arima Kuga、Wakimoto Toshiyuki
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: 25 Issue: 7
  • DOI: 10.1002/cbic.202300838
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Actinobacterial chalkophores: the biosynthesis of hazimycins (2024)
  • Author(s): Matsuda Kenichi、Maruyama Hiroto、Imachi Kumiko、Ikeda Haruo、Wakimoto Toshiyuki
  • Journal Title: The Journal of Antibiotics Volume: - Issue: 4 Pages: 228-237
  • DOI: 10.1038/s41429-024-00706-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Carrier Protein Mediated Formation of the Dihydropyridazinone Ring in Actinopyridazinone Biosynthesis (2023)
  • Author(s): Arima Kuga、Akiyama Satoko、Shin‐ya Kazuo、Matsuda Kenichi、Wakimoto Toshiyuki
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 62 Issue: 29
  • DOI: 10.1002/anie.202305155
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ペニシリン結合タンパク質型チオエステラーゼを用いた環状ペプチドの効率的な化学-酵素合成 (2023)
  • Author(s): 松田研一、脇本敏幸
  • Journal Title: Peptide Newsletter Japan Volume: 7
• [Journal Article] 環状ペプチドの効率的な化学－酵素合成法 (2023)
  • Author(s): 松田研一、脇本敏幸
  • Journal Title: Bioscience & Industry Volume: 81 Pages: 505-508
• [Presentation] Exploration and biocatalytic application of enzymes in specialized metabolism (2023)
  • Author(s): Kenichi Matsuda
  • Organizer: 日本薬学会第144年会（横浜） IS01 次世代薬学アジアシンポジウム ケミカルバイオロジー1
  • Invited
• [Presentation] S19-3 天然物生合成酵素を活用した環状中分子の化学－酵素合成 (2023)
  • Author(s): 松田研一
  • Organizer: 日本薬学会第144年会（横浜） S19 中分子創薬研究のフロンティア －中分子創薬に資する次世代分子技術－
  • Invited
• [Presentation] シアノバクチン生合成におけるグアニジンビスプレニル化酵素の網羅的探索と機能解析 (2023)
  • Author(s): 藤田慧、山田惟人、松田研一、脇本敏幸
  • Organizer: 日本薬学会第144年会（横浜）
• [Presentation] 二環性ペプチドの化学-酵素合成 (2023)
  • Author(s): 小野澤菜帆、小林 雅和、松田 研一、脇本 敏幸
  • Organizer: 日本薬学会第144年会（横浜）
• [Presentation] 30-411-am04 非リボソームペプチド環化酵素を用いたラリアット型環状ペプチドの化学－酵素合成 (2023)
  • Author(s): 小林 雅和、松田 研一、脇本 敏幸
  • Organizer: 日本薬学会第144年会（横浜）
• [Presentation] 非リボソームペプチオ環化酵素を用いたhead-to-side chain型環状ペプチドの化学－酵素合成 (2023)
  • Author(s): 小林 雅和、松田 研一、脇本 敏幸
  • Organizer: 日本農芸化学会2024年度大会
• [Presentation] 有用な天然物生合成酵素の探索とその触媒利用 (2023)
  • Author(s): 松田研一
  • Organizer: 9th BROGHT Symposium
  • Invited
• [Presentation] 二環性ペプチドの化学-酵素合成 (2023)
  • Author(s): 小野澤菜帆、小林 雅和、松田 研一、脇本 敏幸
  • Organizer: 第24回天然薬物の開発と応用シンポジウム
• [Presentation] 抗結核菌活性環状ヘキサペプチド wollamide 生合成における環化酵素 WolJの機能解析 (2023)
  • Author(s): 市原 凜太郎、小林 雅和、藤田 慧、松田 研一、脇本 敏幸
  • Organizer: 第24回天然薬物の開発と応用シンポジウム
• [Presentation] アルギニン選択的環状ペプチドビスプレニル化酵素の網羅的探索と機能解析 (2023)
  • Author(s): 藤田慧、松田研一、脇本敏幸
  • Organizer: 第24回天然薬物の開発と応用シンポジウム
• [Presentation] A New Family of Peptide Cyclases Enabled Streamlined Chemoenzymatic Synthesis of Cyclic Peptide (2023)
  • Author(s): Kenichi Matsuda,Masakazu Kobayashi,Kei Fujita,Toshiyuki Wakimoto
  • Organizer: The 23rd Symposium of the Society of Biocatalysis Japan
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 非リボソームペプチド環化酵素を利用した環状ペプチドの効率的合成法の開発 (2023)
  • Author(s): 小林雅和、市原凛太朗、藤田慧、松田研一、脇本敏幸
  • Organizer: 第65回天然有機化合物討論会
• [Presentation] 非リボソームペプチド環化酵素 WolJ を用いた抗結核菌活性環状ペプチドの構造展開 (2023)
  • Author(s): 市原 凜太郎、小林 雅和、藤田 慧、松田 研一、脇本 敏幸
  • Organizer: 日本生薬学会第69年会
• [Presentation] 二環性ペプチドの化学-酵素合成 (2023)
  • Author(s): 小野澤菜帆、小林 雅和、松田 研一、脇本 敏幸
  • Organizer: 日本生薬学会第69年会
• [Presentation] A New Family of Peptide Cyclases Enabled Streamlined Chemoenzymatic Synthesis of Cyclic Peptides (2023)
  • Author(s): Kenichi Matsuda,Masakazu Kobayashi,Kei Fujita,Toshiyuki Wakimoto
  • Organizer: 3rd Japan-Switzerland-Germany Workshop on Biocatalysis and Bioprocess Development
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] アルギニンビスプレニル化酵素の探索と機能解析 (2023)
  • Author(s): 藤田慧、松田研一、脇本敏幸
  • Organizer: 第55回若手ペプチド夏の勉強会
• [Presentation] 非リボソームペプチド環化酵素WolJを用いた抗結核菌活性環状ペプチドWollamideの構造展開 (2023)
  • Author(s): 市原 凜太郎、小林 雅和、藤田 慧、松田 研一、脇本 敏幸
  • Organizer: 第55回若手ペプチド夏の勉強会
• [Presentation] アルギニンビスプレニル化酵素の探索と機能解析 (2023)
  • Author(s): 藤田慧、松田研一、脇本敏幸
  • Organizer: 第15回化学生態学研究会
• [Presentation] 二環性ペプチドの化学-酵素合成 (2023)
  • Author(s): 小野澤菜帆、小林 雅和、松田 研一、脇本 敏幸
  • Organizer: 第47回日本生薬学会北海道支部例会
• [Presentation] Streamlined chemoenzymatic synthesis of cyclic peptides by non-ribosomal peptide cyclases (2023)
  • Author(s): Kenichi Matsuda,Masakazu Kobayashi,Kei Fujita,Toshiyuki Wakimoto
  • Organizer: NextGenBiocat 2023
  • Int'l Joint Research