１細胞解像度で紐解く不均質な細菌群集からの亜集団発生

• Project/Area Number: 23K17852
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 27:Chemical engineering and related fields
• Research Institution: Waseda University
• Principal Investigator: 細川 正人 早稲田大学, 理工学術院, 准教授(任期付) (60722981)
• Project Period (FY): 2023-06-30 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2024: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2023: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: トランスクリプトーム

Outline of Research at the Start

細菌の遺伝子発現は、同じ実験室条件で培養された集団内でも不均一である。しかし、集団内で、どの細菌がどの遺伝子を発現しており、どんな亜集団がいるのか？という問いに答えられる技術はない。そこで本研究では、細菌の細胞１つから遺伝子発現状況を網羅的に解析する手法を開発し、細菌集団の不均質性を定量的に評価する。

Outline of Annual Research Achievements

細菌の遺伝子発現は、同じ実験室条件で培養された集団内でも不均一である。しかし、集団内で、どの細菌がどの遺伝子を発現しており、アクティブな亜集団を形成しているのか？という問いに答える技術はない。これには、「細胞１つあたりの検出遺伝子数(カバレッジ)」と「細胞数(スケール)」を十分に備えた計測が必要である。こで本研究では、カバレッジとスケールの両要求を満たしたロバストで再現性の高い細菌シングルセルRNA-seqを開発し、細菌集団の不均質性解析の標準的な研究法を確立することを目的とした。
本研究で掲げるカバレッジとスケールを備えたscRNA-seqを実現するために、(1)高出力なcDNA増幅、(2)rRNAの排除、(3)万単位の超並列シーケンス対応を計画した。今年度は、高感度なcDNA増幅の基本原理を維持しつつ、rRNAの除去効率を高める反応条件の検討を進めた。対象は大腸菌とした。細菌用プライマー設計によりrRNAを回避したcDNA増幅法に改良したところ、データ改善効果が確認された。ただし、その効果は想定値と比べて十分ではなかったため、プライマー設計以外の反応の別工程の改良を継続している。また、現在はウェルプレートベースで数百単位の並列反応が可能であるが、反応条件の再設計により複数のウェルプレートを実施することで、千単位での並列シーケンスが原理的に可能であると試算された。今後は、rRNA除去率を最適化したcDNA増幅条件にて、大規模なシーケンスデータ取得を予定している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初目的としていたcDNA中のrRNA除去を目的とした反応の効果を認めた。一方で、その除去率には課題を残しており、条件検討を継続する。

Strategy for Future Research Activity

rRNA除去に係る反応プロセスの最適化を進める。最適化したcDNA増幅条件にて大規模なシーケンスデータ取得を予定し、シングルセルトランスクリプトームデータ取得の効率向上効果を評価する。

Research Products

• [Journal Article] Enhancing the sensitivity of bacterial single-cell RNA sequencing using RamDA-seq and Cas9-based rRNA depletion (2023)
  • Author(s): Nishimura Mika、Takeyama Haruko、Hosokawa Masahito
  • Journal Title: Journal of Bioscience and Bioengineering Volume: 136 Issue: 2 Pages: 152-158
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2023.05.010
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 未培養微生物の可能性を解き放つ: シングルセル解析からバイオものづくりへの展望 (2024)
  • Author(s): 細川 正人
  • Organizer: 化学生命工学講演会「化学生命の最前線２」
  • Invited
• [Presentation] 高感度な細菌scRNA-seq技術を用いた細菌集団不均一性の解明 (2024)
  • Author(s): 西村美郁, 竹山春子, 細川正人
  • Organizer: 第12回生物工学会東日本コロキウム
• [Presentation] Advances in Single-Cell Technologies: Analyzing Bacterial Genomes and Gene Expressions (2024)
  • Author(s): Masahito Hosokawa
  • Organizer: UQ-Waseda University Joint Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] マイクロバイオームの精密解析、ビッグデータからものづくりへの展開 (2024)
  • Author(s): 細川 正人
  • Organizer: 日本化学会 第104春季年会(2024) イノベーション共創プログラム（CIP）：デジタルヘルスケアの最前線
  • Invited
• [Presentation] バクテリアのシングルセルRNA-seqで何ができるか (2023)
  • Author(s): 細川 正人
  • Organizer: 大隅基礎科学創成財団 微生物コンソーシアム定例会
  • Invited
• [Presentation] ヒト共生・未培養微生物におけるシングルセルゲノム解析の活用法 (2023)
  • Author(s): 細川 正人
  • Organizer: 第27回腸内細菌学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] 細菌集団の不均一な遺伝子発現状態を識別するための高感度な細菌1細胞RNA-seq手法の開発 (2023)
  • Author(s): 西村美郁, 竹山春子, 細川正人
  • Organizer: 第75回 日本生物工学会大会
• [Presentation] 細菌1細胞由来の微量mRNAに対する高感度なシングルセルRNA-seq手法の開発 (2023)
  • Author(s): 西村美郁, 竹山春子, 細川正人
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会、神戸ポートアイランド