| Project/Area Number |
23K17868
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 28:Nano/micro science and related fields
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| Research Institution | Kansai University |
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Principal Investigator |
葛谷 明紀 関西大学, 化学生命工学部, 教授 (00456154)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | 生物発光共鳴エネルギー移動 / DNA / 発光タンパク質 |
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| Outline of Research at the Start |
研究代表者が独自に開発した「DNAを足場とした分子内生物発光エネルギー移動システム」を活用して、「生物発光顕微鏡観察法」を飛躍的に発展させるための「マルチカラー生物発光素子」を開発することを目的とする。さらにこれを抗体などのラベル化剤として応用し、全く新しい「発光免疫染色法」や「超解像発光顕微鏡法」、さらには「電源を使用せず化学エネルギーのみで駆動する生物発光ディスプレイデバイス」の開発をめざす。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究で使用する「DNA足場生物発光素子」は、Alexa Fluor594とFAMをアクセプターとして利用する生物発光素子を基本とし、特殊モノマーを使用してアミノ化などのさらなる化学修飾をDNA足場に施すことで、これらを抗体やDNAオリガミなどと結合できる「多色発光ラベル化剤」へと応用することをめざしている。
1. DNA足場生物発光素子をラベル化剤として活用する発光免疫染色法の開発：まずは、その利用場面が最も広いと期待される免疫染色法で、DNA足場生物発光素子を利用することを検討した。二重らせんのうちNanoLucを再構成する末端と反対側の末端をビオチン化したDNA鎖をDNA自動合成機で合成した。一次抗体として使用する抗チューブリンマウスIgGをビオチン化し、これに対してストレプトアビジンを介して擬二次抗体としてビオチン化DNA足場生物発光素子を結合させた。固定化したHeLa細胞に対して、これらの標識抗体を使用して免疫染色することで、細胞内の微小管からの生物発光を顕微鏡で観察することに成功した。
2. DNA足場生物発光素子を明滅光源とするマルチカラー超解像「発光」顕微鏡法の開発：DNAオリガミ上に結合したDNA足場生物発光素子からの発光を単分子顕微鏡観察するために、三角形の形状をしたDNAオリガミの各辺に、2分子ずつのDNA足場生物発光素子の結合部位を導入した。原子間力顕微鏡でDNAオリガミ全体の構造を確認すると共に、マイクロプレートリーダー上でDNA足場生物発光素子からの青、緑、赤色の発光を同時に観察することに成功し、設計通りの複合体が形成されており、DNAオリガミ上でもDNA足場生物発光素子が問題なく機能することを確かめた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
固定した細胞の生物発光免疫染色に成功し、今後の多色標識へのめどがたった。DNA足場生物発光素子を明滅光源とするマルチカラー超解像発光顕微鏡法の開発についても、三角形DNAオリガミへのDNA足場生物発光素子の固定化に計画通り成功し、今後の超解像観察への準備を整えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終的な目標としている多色での生物発光免疫染色法を確立するために、IgG抗体へのDNA足場生物発光素子の直接的なアミドカップリングを試みる。具体的には、一次抗体として抗チューブリンマウスIgGに加えて、抗アクチンヒトIgGの標識を検討する。また、二次抗体として使用する抗マウスIgGや、抗ヒトIgGへの標識も試みる。
マルチカラー超解像発光顕微鏡法の開発については、作成に成功したDNA足場生物発光素子を結合した三角形DNAオリガミをガラス基板上に固定化し、顕微鏡で単分子観察することを試みる。
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