近位依存性ビオチン化酵素を利用した植物体内での相互作用タンパク質解析技術の開発

• Project/Area Number: 23K18008
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 野澤 彰 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (30432800)
• Project Period (FY): 2023-06-30 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2024: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2023: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: タンパク質間相互作用 / ビオチン化酵素 / 植物 / 近位依存性ビオチン化酵素

Outline of Research at the Start

本申請課題では、常温域で活性を有する常温型AirIDの取得に挑戦する。常温域で生育する微生物のビオチンリガーゼの配
列を基準配列に用いて祖先型配列作成アルゴリズムにより作成する。人工的にデザインした酵素の活性を無細胞系を利用したin vitroの系と形質転換植物を利用したin vivoの系により検証する。また、得られた常温型AirIDを利用して植物体内での相互作用タンパク質解析技術の開発を行う。

Outline of Annual Research Achievements

多くのタンパク質は生体内で他のタンパク質と複合体を形成して機能していることから、あるタンパク質の生体内でのはたらきを理解するためには、そのタンパク質と生体内で相互作用するタンパク質を明らかにすることが重要である。我々は、2020年に近接するタンパク質をビオチン化できる新規酵素AirIDの開発に成功した。AirIDを標的タンパク質と融合させ細胞内で発現させることで、ビオチン化を指標として標的タンパク質と生体内で相互作用するタンパク質を同定することが可能となった。しかし、AirIDのビオチン化活性は37℃付近で最大であり植物の生育温度である15~25℃の常温域では活性が低いことが明らかになった。そこで本申請では、植物の生育温域である常温域で高い活性を示す常温型AirIDを作出し、植物体内で相互作用タンパク質を網羅的に解析する技術の開発を目指すこととした。令和５年度は低温域で生活する生物のビオチン化酵素の配列をもとに人工的にデザインした常温型AirIDを作成し、AirIDとの比較解析を行った。これらの酵素とCBL4との融合タンパク質を無細胞系で合成し、CIPK15のビオチン化実験を行った結果、CBL4-AirIDでは26℃以下ではCIPK15のビオチン化はほとんど見られなかったのに対し、CBL4-常温型AirIDでは16℃以上の温度域でCIPK15のビオチン化が確認された。これらの結果から、期待通りに常温域でビオチン化活性の高い酵素が取得されたことが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

期待通りに常温域でビオチン化活性の高い酵素の取得に成功し順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

今後は、得られた常温型AirIDと通常のAirIDについて植物体内でのビオチン化活性の比較を行う。CBL4との融合タンパク質を発現する形質転換植物を作成しビオチン化されるタンパク質の比較解析を行う。