| Project/Area Number |
23K18100
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
吉久 徹 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (60212312)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
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| Keywords | tRNA / 酵母 / 修飾状態 / 可視化 / アミノアシル化 / シュードウリジン / RNA / 修飾 / 細胞内動態 |
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| Outline of Research at the Start |
本計画では修飾RNAの空間分布を分析する新たな手法の開発を、出芽酵母におけるtRNAの修飾をproof-of-conceptの対象として行う。具体的には、１）アミノアシル化状態、２）tRNA-TyrGUAの35位等に見られるpseudouridine（Ψ）修飾の2例を中心に、その可視化法の開発に挑む。
次に、これらの新規技術を、酵母の栄養飢餓時に脱アシル化tRNA特異的な細胞内分布変化が見られるか、tRNA-TyrGUAのΨ修飾欠損時にその品質管理はどこで行われるか、の解析に適用することで、研究面での実用性を検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、RNA-seqによる高感度かつ網羅的な転写産物分析技術の発達によって、1細胞レベルのtranscriptomeを解析したり、逆転写酵素（RTase）が一部のRNA修飾に感受性を持つことを逆手に取って、網羅的なRNA修飾パターンを解析したりすることが可能となった。一方で、現在の修飾RNAの解析は、細胞より分離・精製した RNA画分を対象としているため、各RNA分子が持っていた細胞内での空間情報が失われている。そこで本計画では、修飾RNAの細胞内分布を分析する新たな手法の開発を試みている。具体的には、我々の開発したtRNA絶対定量法であるOTTER法等をベースに、出芽酵母におけるtRNAをproof-of-conceptの対象として修飾状態の可視化法を開発する。tRNAに見られる多くのヌクレオチド修飾のうち、アミノアシル化とシュードウリジン化（Ψ化）に着目して研究を進める。本年度はアミノアシル化tRNAの特異的検出法の確立を中心に研究を進め、少なくとも固定した細胞を用いたOTTER法によって、tRNAの3'末端のCCA配列の有無を識別してtRNAを可視化できる事を確認した。次に、tRNAの3'末端のリボースのジオールに対する過ヨウ素酸酸化に対してアミノアシル基が保護基として働くこと想定し、調製したRNA標品に対してアミノアシル化tRNAにのみ蛍光ヌクレオチド導入するOTTER法の条件を検討した。その結果、アミノアシル化状態特異的な蛍光ヌクレオチド導入条件の設定に成功した。また、この解析の副産物として、通常、ほとんどのアミノアシル化tRNAが脱アシル化されるとされてきた標準的な脱アシル化反応では、酵母tRNA-IleUAUの脱アシル化は不十分にしか起こらず、より高いpHと高い温度が必要であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
計画実施の開始が採択決定後の7月以降であったことは当初想定されていたが、RNA標品を用いたアミノアシル化状態検出法を固定した酵母細胞上で再現するための条件検討を年度内に開始する予定であった。しかし、RNA標品を用いた実験で、モデルケースとして取り上げたtRNA-IleUAUをはじめとするtRNAの脱アシル化条件の再検討、過ヨウ素酸酸化、DNA鋳型とtRNAとのアニーリングなどの条件検討に手間取り、また、実験を担当する学生の入れ替えも重なり、固定細胞への適用の条件検討が2024年度に移ってからとならざるを得なかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
〇アミノアシル化tRNAの特異的可視化 昨年度に引き続き、アミノアシル化tRNAの可視化法の確立を目指す。更に、この可視化法を、窒素源飢餓時の酵母において見られるtRNAの細胞内動態とアミノアシル化状態の関係の解析に適用する。窒素源飢餓時には、tRNAがサイトゾルから核へと移動すること、また、オートファジーによって液胞へ運ばれて分解されることが知られている。他方、サイトゾルではアミノ酸合成系の酵素群が翻訳されなくてはならず、一定レベルのアミノアシル化tRNAが必要とされる。こうした事から、サイトゾルから核、あるいは、液胞へと輸送されるtRNAが、直接翻訳の基質とならない脱アシル化tRNAに限られている可能性があり、こうした可能性を本手法によって検討する。
〇Ψ化tRNAの特異的可視化 上記と並行して、特定のUがΨに修飾されたtRNAのみを可視化する手法を検討する。この際、ΨのみがCMCによる修飾を受けることと、この修飾塩基は逆転写酵素（RTase）をブロックすることを利用する。Ψ化されていないtRNAにアニールしたオリゴDNAにはRTaseによって末端にdideoxy ATP（ddATP）が取り込まれ、terminal deoxynucleotide transferase（TdTase）によるDNAの伸張が阻止されるのに対し、Ψ化tRNAはRTaseによってddATPが取り込まれず、TdTaseの働きで蛍光ヌクレオチドが導入される条件を検討、特定tRNA上の特定のヌクレオチドのΨ化状態を反映した可視化法（modification-dependent fluorescence in situ tailing法）を確立する。
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