| Project/Area Number |
23K18106
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
豊島 近 東京大学, 定量生命科学研究所, 特任教授 (70172210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金井 隆太 東京大学, 定量生命科学研究所, 特任講師 (50598472)
西山 尚志 東京大学, 定量生命科学研究所, 特任助教 (30647011)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
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| Keywords | 反応中間体 / 立体障害 / 変異体 / 構造解析 / カルシウムポンプ |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、筋小胞体カルシウムポンプのように、天然の中間体間では構造変化が大きすぎてそのメカニズムを簡単には理解できない系に対し、蛋白質に立体障害を導入する（「コブ」をはやす）ことによって構造変化を途中で止め、人工的反応中間体を創成する技術を開発する。コブの大きさを変えることによって多数の反応中間体の生成を可能にする一般的技術となり、今後の構造生物学に大きな変革をもたらす可能性がある
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ca2+ポンプ作動機構の構造的解明の過程で阻害剤で止められる中間体の構造は全て決定し、能動輸送機構の大略は理解することができた。しかし、膜内に隔離したCa2+を内腔側に放出する過程、すなわちE1P.ADP.2Ca2+からE2Pに至る過程は、構造変化が大きすぎるためにそのメカニズムがよくわからなかった。そこで、その間に位置する人工的中間体を創出することを考え、立体障害の導入を試みた。立体障害としては側鎖レベルからへリックス、超二次構造まで多くの可能性があるが、まずは点変異体から始め、4つの変異体を設計し、長時間の分子動力学計算によって安定性を検討するとともに、実際に高等動物培養細胞にて大量生産し、蛋白質分解酵素を用いた部分分解によるfoldingの検討を行った。ツールとしてRosettaを採用し、テンプレートを用いてへリックスの導入も試みたが、期待通りの結果は得られなかった。また、数残基の挿入ではアルファフォールドのによる予測は無力であることも分かった。設計した4つの変異体はすべて大量生産し、そのうち2つについてはクライオ電顕による予備的検討を終えた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
点変異体から始め、4残基挿入を二つの方法で挿入したものを大量生産、評価までできたので方法論を確立できた。順調に推移していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
系を確立できたので、中間体の系統的な生成に向けて、挿入位置、挿入配列の最適化を試みるとともに、実際の構造決定に挑戦する。Ca2+ポンプの場合、これまでにNa+ポンプで成功してきた条件では、単量体から三量体（あるいはそれ以上）のゆるい複合体を作ることが判明し、クライオ電顕による立体構造決定には困難が予想される。クライオ電顕試料の条件検討には時間を要するかもしれない。
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