Development of RNA dynamics recording and study of RNA mediated regulatory gene network

• Project/Area Number: 23K18108
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 秋光 信佳 東京大学, アイソトープ総合センター, 教授 (40294962)
• Project Period (FY): 2023-06-30 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2024: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000); Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
• Keywords: RNA / gene

Outline of Research at the Start

外的刺激に応答した遺伝子発現変動では、転写・スプライシング・RNA分解などの複数の制御が同時かつダイナミックに変化する。しかしながら全遺伝子について、これらの制御を同時計測する手段は無かった。本研究では、複数の核酸アナログで細胞内RNAを標識することで、刺激後の経時的な転写・スプライシング・RNA分解を網羅的かつ同時に計測する “RNA dynamics recording” 技術を開発する。さらに数理モデリングやグラフ理論を適用することで、外的刺激による遺伝子制御ネットワークの経時的変化の全貌を解明する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、複数の核酸アナログで細胞内RNAを標識することで、外的刺激を受けた細胞における経時的な転写・スプライシング・RNA分解を網羅的かつ同時に計測する “RNA dynamics recording” 技術を開発する。この研究における重要な課題は、核酸アナログで細胞内RNAを標識することで、転写・スプライシング・RNA分解の経時的変化を「RNA分子への核酸アナログの取り込み履歴」として記録する新規技術 "RNA dynamics recording” の開発である。さらに数理モデリングやグラフ理論を適用することで、外的刺激による遺伝子制御ネットワークの経時的変化の全貌を解明する。
本年度は、4-thiouridineと6-thioguanosineをつかった細胞内RNA標識条件を検討した。いずれも細胞毒性を示す化合物であるため、作用濃度と時間を設定することが重要であるためである。毒性評価は、細胞生存アッセイと次世代シーケンス解析による遺伝子発現プロファイリングおよび主成分分析を組み合わせておこなった。その結果、HeLa細胞における最適な薬物濃度と標識時間を決めることができた。
次に、4-thiouridineと6-thioguanosineをそれぞれシチジンとアデノシン*に変換する反応（酸化オスミウムを用いたTUC反応）の至適条件を系統的に検討し、至適条件を確定した。現在、このTUC反応条件をつかって、細胞から精製した4-thiouridineと6-thioguanosineの二重標識RNAにおける標識部位を特定する実験をおこなっている。標識部位の同定では、RNA-seqデータをリファレンスゲノムにマッピングする際のT＞C置換とG>A置換の検出が必須であるが、既存のバイオインフォマティックスツールを改良することで、塩基置換反応の検出が可能になった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初計画したとおりに実験をすすめ、期待する条件を確定できていることから、上記のとおり判断した。

Strategy for Future Research Activity

本研究目標として掲げる新規技術 "RNA dynamics recording” の開発を完成する。その上で、細胞に各種ストレス処理（熱ショック、浸透圧ストレス、薬物処理、栄養飢餓など）したときの遺伝子発現プロファリングの変化、およびその変化を説明する転写・スプライシング・RNA分解の経時的変化をRNA dynamics recording技術によって明らかにする。さらに、機械学習の手法（特徴ベクトルのテンソル積や拡散カーネル）を用いて、遺伝子発現の連関を解明することで、「どの遺伝子が、どの制御に影響を与えるか」を包括的に明らかにする。そのうえで、包括的遺伝子制御ネットワークを解析することで、RNAの協調制御がもたらす生物学的利点を、理論的立場から解明することを試みる。グラフ理論から、多数の要素因子 (ノードと呼ぶ、本研究ではRNAに相当) が少数ノードを制御する “多入力単出力” 制御がネットワークの頑健性を規定する。遺伝子発現制御は転写・スプライシング・RNA分解といった多数の入力が少数遺伝子を制御する多入力単出力であり、包括的GRNの解析により頑健性や選択的デコード特性が創発する原理の解明が可能となると期待している。