| Project/Area Number |
23K18191
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 47:Pharmaceutical sciences and related fields
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
荒井 緑 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (40373261)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | PROTAC / 天然物 / アルツハイマー / タウ / 分子のり / エキス |
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| Outline of Research at the Start |
疾病に関わるタンパク質をユビキチンリガーゼに強制的に結合させて安定化し，ユビキチン化の後，プロテアソームで分解させる化合物のことを近年「分子のり」と呼ぶ．本研究では脳に発現しているユビキチンリガーゼを用い，アルツハイマー病の原因タンパク質であるタウタンパク質を強制的に分解できる化合物を天然物基盤で開発する．
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| Outline of Annual Research Achievements |
疾病に関わるタンパク質をユビキチンリガーゼに強制的に結合させて安定化し，ユビキチン化の後，プロテアソームで分解させる化合物のことを近年「分子のり」と呼ぶ．本研究では，脳に発現しているユビキチンリガーゼ中のCerebron (CRBN)を用い，アルツハイマー病の原因タンパク質であるタウタンパク質を強制的に分解できる化合物を天然物基盤で開発する．放線菌エキス中の天然物に化学反応でCRBNを認識するリガンドを連結した「人工天然物エキス」を作成し，タウタンパク質に結合する化合物を申請者独自の「タンパク質ビーズ法」で釣り上げる方法論を開拓する．すなわち，片方のタンパク質リガンドをエキスに結合させ，もう片方のタンパク質ビーズで釣り上げることで，両方のタンパク質に結合する化合物，分子のりを迅速に，天然物ベースで得ることができる．本年度は，CRBNのリガンドとしてポマリドミドを選択し，天然物エキスをアルキル化した後，ポマリドミドアジドとクリック反応を行うことで，人工天然物エキスの作成方法を確立することに成功した．まず，ポジティブコントロールとしてフェノール性化合物を選択し，天然物エキスの中に混合して，アルキニル化の条件を確立した．またここにポマリドミドアジドを加え，同触媒によりクリック反応を行い，天然物エキスという天然物の混合物の中でもクリックが進行することを確認した．
実際の天然物を含むエキスでもPROTAC合成に成功した．また，タウビーズ法の構築，さらにCRBNとタウの両方に結合する化合物を検出する傾向プレートアッセイ系の構築にも成功している．プレートアッセイ系では別途，タウ分解分子のり候補天然物を得ており，その生物活性も評価中である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は，CRBNリガンドとしてポマリドミドを選択し，天然物エキスをアルキニル化したのち，クリック反応でポマリドミドアジドと種々天然物を反応させ結合させる方法論の開発を行った．ポマリドミドアジドはまず購入品を用いたが，実際に研究室で合成して供給する方法も確立した．まず，ポジティブコントロールとしてフェノール性化合物を選択し，天然物エキスの中に混合して，アルキニル化の条件を確立した．またここにポマリドミドアジドを加え，同触媒によりクリック反応を行い，天然物エキスという天然物の混合物の中でもクリックが進行することを確認した．さらに，実際の天然物が含まれるエキスを用い，その天然物がアルキニル化され，ポマリドミドアジドとクリック反応により，PROTAC候補化合物がエキスの中で合成させることを確認した．すなわち，人工天然物エキスの作成に成功した．
また，タウビーズ法の構築，さらにCRBNとタウの両方に結合する化合物を検出する傾向プレートアッセイ系の構築にも成功している．プレートアッセイ系では別途，タウ分解分子のり候補天然物を得ており，その生物活性も評価中である．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はまず，人工天然物エキスの構築方法の改良を行う．種々試薬の等量や，反応時間等を検討する．検討を終えてすぐ，人工天然物エキスライブラリーの作成を行う．ライブラリーを作成するにあたって，ポマリドミドアジドの量上げ合成を行う．また，上記の既知天然物PROTACを別途，化学合成し，天然物エキス内での生成物の同定を行う．さらにこのPROTACの生物活性を評価する．
人工天然物エキスライブラリーは，当研究室保有の放線菌ライブラリーのうち，天然物混合物のHPLCでのUV吸収ピークが明瞭なものを選択する．100から500の人工天然物ライブラリーを作成する．その後，タウビーズ法により，タウに結合する化合物を見いだす．タウ担持ビーズとライブラリーを4度で混合し，その後，結合しなかった化合物を洗浄し，結合した化合物はエタノールを加えて解離させ，HPLCで検出する．得られたピークを指標に大量調整した人工天然物エキスからタウに結合する化合物を単離・構造決定する．得られた化合物のCRBNとタウの両方に結合する活性があるかを，CRBN蛍光プレートアッセイにより評価する．さらに，タウを実際に細胞内で分解できるか，タウ強制発現細胞に処理し，Western blotにて評価する．
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