| Project/Area Number |
23K18195
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 48:Biomedical structure and function and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
坪井 貴司 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (80415231)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
末次 憲之 東京大学, 大学院総合文化研究科, 准教授 (60514156)
原田 一貴 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (60830734)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | キナーゼ / ホルモン分泌 / フォトトロピン |
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| Outline of Research at the Start |
小腸内分泌細胞は、消化管ホルモン分泌を正しく行うために、異なる刺激によって起こるcAMPやcGMPのシグナルを区別しなければならないが、cAMPやcGMPの濃度変化の時空間的な制御は極めて困難である。そこで本研究では、光受容体キナーゼを利用して、cAMPやcGMPの下流ではたらくキナーゼであるPKAやPKGの緻密な時空間制御を可能にする光スイッチ型キナーゼを開発することにより、タンパク質リン酸化を介した消化管ホルモン分泌制御機構を解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
小腸内分泌細胞は、消化管ホルモン分泌を正しく行うために、消化管管腔内に存在する様々な刺激によって起こるcAMPやカルシウム、そしてcGMPのシグナルを区別しなければならない。しかしながら、光を用いて、cAMPやカルシウム、そしてcGMPの濃度変化の時空間的な制御は極めて困難である。
そこで本年度は、コムギ胚芽抽出液を用いた試験管内発現系を用いて、フォトトロピンのコドンを動物用に最適化したヒザオリ由来のネオクロムを発色団であるフィコシアノビリン合成タンパク質（ヘムオキシゲナーゼとビリン還元酵素PcyA）と共に発現させ、赤色光/遠赤色光の照射によってキナーゼの活性を可逆的にコントロールできる実験系の確立に取り組んだ。
まず、ヒザオリ由来のネオクロムのキナーゼドメインを消化管ホルモンの分泌調節に関わるプロテインキナーゼA（PKA）やプロテインキナーゼC（PKC）、そしてプロテインキナーゼG（PKG）のキナーゼドメインと置換したもの（ネオキナーゼ）の作出に取り組んだ。上記の実験と並行して、赤色光/遠赤色光の照射に反応しないネオキナーゼ変異体も作成した。ネオクロムはそれ自体のタンパクのサイズが大きいため、今後用いる動物細胞で正しく発現しない可能性が考えられる。そこで、動物細胞において、これらのキナーゼの発現を容易にするために、ネオキナーゼの光スイッチ機能に影響を与えない領域について、さまざまな領域を欠失させた分子量の小さいネオキナーゼも作出にも取り組んだ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ネオクロム遺伝子の遺伝子内部に、遺伝子増幅する際、増幅の難しい塩基配列箇所が多数あることがわかった。そのため、ネオクロムのキナーゼドメインのPKAやPKGのキナーゼドメインと置換や赤色光/遠赤色光の照射に反応しないネオキナーゼ変異体の作出に手間取ったため、当初の予定よりも、実験がやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、コムギ胚芽抽出液を用いたフォトトロピンの試験管内発現系を用いて、コドンを動物用に最適化したヒザオリ由来のネオクロムを発色団フィコシアノビリン合成タンパク質と共に発現させ、赤色光/遠赤色光の照射によりその活性を可逆的に調節できるキナーゼ活性解析系を確立する。平行して、ホルモンを分泌する小腸内分泌細胞株にネオキナーゼを導入し、ホルモン分泌への影響について解析する。
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