Development of a method for activation of costimulatory immune receptors by using their corresponding multimerized ligands

• Project/Area Number: 23K18212
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 49:Pathology, infection/immunology, and related fields
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 宗 孝紀 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 教授 (60294964)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石井 直人 東北大学, 医学系研究科, 教授 (60291267)
• Project Period (FY): 2023-06-30 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2024: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: T細胞 / TNF受容体 / TNFリガンド / 補助刺激 / 免疫制御 / リコンビナントタンパク質 / TNF / TNFR / 補助刺激シグナル / サイトカイン

Outline of Research at the Start

感染症やがんによる社会問題は今後さらに増加することが予想され、有効な治療法の開発が求められています。T 細胞に発現するTNF受容体、OX40、4-1BB、CD27、GITR は、免疫制御分子として、防御免疫の確立に寄与します。しかし、TNF受容体の機能活性をどのように引き出し、応用するかに関する情報が不足しています。本研究では、TNF受容体を活性化できるTNFリガンドの構造要素と種類に関する情報を取得し、これをもとに、TNF 受容体を最適に活性化できる分子を作製し、感染症やがんを克服できる有効な T 細胞制御法の確立を目指します。

Outline of Annual Research Achievements

感染症や癌が社会に及ぼす影響は、今後も引き続き重要になっていくと予想される。適応免疫の中心的役割をはたすT細胞は、外部からの細菌やウイルスのみならず、内部で発生した癌を特異的に認識し、これらの異物を体内から排除するようにはたらく。免疫機構の基本原理に基づいて、T細胞の機能に重要な役割を果たすサイトカインの機能を制御し、このことにより疾患の克服を目指す研究がこれまで行われてきた。申請者らが着目するTNF受容体OX40、4-1BB、CD27、GITRは、免疫補助刺激受容体としてT細胞に発現することで抗原受容体TCRの機能を制御し、T細胞の増殖・分化・生存を促し、エフェクター/メモリーT細胞の産生を増加させる。このTNF受容体の活性が、感染やがんに対する防御免疫に重要な役割を果たす。本研究は、T細胞の機能制御の観点から、TNF受容体を最適に活性化できるTNFリガンドタンパク質分子を創製し、その機能をin vitroおよびin vivoにおける実験により検証することで、画期的なT細胞制御法の確立に挑戦することを目的とする。
本年度は、それぞれのTNF受容体に対するTNFリガンド分子OX40L、4-1BBL、CD27L(CD70)、GITRLに関して、異なる構造を持つタンパク質分子を調製するための研究を行なった。具体的には、該当するTNFリガンドタンパク質の元になる遺伝子をPCRにより合成し、これを高発現ベクターにクローニングし、CHO細胞などの細胞を用いて、培養上清中からタンパク質を分離精製する実験系を確立した。精製したTNFリガンドタンパク質を用いて、in vitroでマウスの脾臓より精製したCD4+ および CD8+ T細胞を刺激し、調製したTNFリガンドタンパク質にアゴニスト活性があることを確認できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

課題１（分子を作製し、in vitro で機能を評価する）に関して、TNFリガンドタンパク質の遺伝子の作成、HEK293T細胞およびCHO細胞を用いた発現系の構築、Protein Aやタグ抗体によるカラム精製に関する実験系を確立し、in vitro においてその機能を評価する実験系も確立できた。課題２（機能を最適化した分子を創る）に関して、OX40Lにおいて、異なる分子を作製し、その機能を in vitro で評価した結果、多量体化度の高いOX40Lに強いT細胞刺激活性が認められた。課題３（in vivo で機能を評価する）に関して、TNFリガンドタンパク質をマウスに投与した後に、抗原とアジュバントでマウスを免疫し、in vivoにおけるT細胞応答を評価した。その結果、独自に作製したOX40L、4-1BBL、CD70、GITRLタンパク質に確かに刺激活性があることを確認できた。異なるタンパク質の構造をもつそれぞれのOX40Lに関して、in vitroとin vivoでのT細胞刺激活性が対応せず、タンパク質の構造因子以外がin vivoでのアゴニスト活性に関係することが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

今後、特に課題３（in vivo で機能を評価する）に関して、腫瘍実験モデル等の in vivo実験で必要となる各TNFリガンドタンパク質に関して、細胞の大量培養を行い、培養上清から実験に必要な量のタンパク質を精製する。マウスを用いたモデル抗原とアジュバントを用いた基礎免疫学実験および同系腫瘍移植モデルにより、TNFリガンドタンパク質の種類および構造がT細胞応答に及ぼす影響を評価する。課題４（ヒト化分子を創り、機能を調べる）に関して、TNFリガンドのマウスの配列をヒトに置換したタンパク質を調製し、ヒトT細胞に対する機能を評価する。得られた結果を研究成果として報告する。

Research Products

• [Presentation] Structural and functional characterization of recombinant OX40 ligand fusion proteins. (2024)
  • Author(s): Ayaka Sato, Mitsuki Azuma, Hodaka Nagai, Aya Ito, Masashi Morita, Mari Hikosaka-Kuniishi, Naoto Ishii, Takanori So.
  • Organizer: The 52nd Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology.
• [Presentation] Functional characterization of antibody fusion-single-chain TNF proteins that agonize costimulatory TNFR expressed by T cells. (2024)
  • Author(s): Hodaka Nagai, Mitsuki Azuma, Ayaka Sato, Sayaka Ogawara, Yuta Tsutsui, Ayano Suzuki, Shimpei Matsuyama, Tomomi Wakaizumi, Masashi Morita, Mari Hikosaka-Kuniishi, Naoto Ishii, Takanori So.
  • Organizer: The 52nd Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology.
• [Presentation] Basic characterization of TNF ligand-based agonists targeting OX40, 4-1BB, CD27, and GITR expressed by T cells. (2024)
  • Author(s): Takanori So, Hodaka Nagai, Mitsuki Azuma, Ayaka Sato, Ayano Suzuki, Aya Ito, Masashi Morita, Mari Hikosaka-Kuniishi, Naoto Ishii.
  • Organizer: The 52nd Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology.
• [Presentation] T細胞に発現するTNF受容体ファミリー分子OX40の機能を制御するOX40リガンドタンパク質の構造と機能評価. (2024)
  • Author(s): 佐藤 綾香, 東 充輝, 永井 穂高, 鈴木 綾乃, 伊藤 文, 守田 雅志, 國石（彦坂） 茉里, 宗 孝紀.
  • Organizer: 日本薬学会第144年会.
• [Presentation] Structural requirement of soluble OX40 ligand protein for efficient induction of co-stimulatory signaling mediated by OX40. (2023)
  • Author(s): Ayaka Sato, Mitsuki Azuma, Hodaka Nagai, Nagito Shibui, Sayaka Ogawara, Yuta Tsustui, Ayano Suzuki, Aya Ito, Tomomi Wakaizumi, Shimpei Matsuyama, Masashi Morita, Mari Hikosaka-Kuniishi, Takanori So.
  • Organizer: 7th Toyama-Basel Joint Symposium 2023.
• [Presentation] Functional evaluation of single-chain TNF ligand-Fc fusion proteins for activation of co-stimulatory TNF receptors expressed by T-lymphocytes. (2023)
  • Author(s): Hodaka Nagai, Mitsuki Azuma, Ayaka Sato, Nagito Shibui, Sayaka Ogawara, Yuta Tsutsui, Ayano Suzuki, Tomomi Wakaizumi, Aya Ito, Shimpei Matsuyama, Masashi Morita, Mari Hikosaka-Kuniishi, Takanori So.
  • Organizer: 7th Toyama-Basel Joint Symposium 2023.