| Project/Area Number |
23K18227
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 49:Pathology, infection/immunology, and related fields
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| Research Institution | Matsuyama University |
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Principal Investigator |
玉井 栄治 松山大学, 薬学部, 教授 (40333512)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神鳥 成弘 香川大学, 医学部, 教授 (00262246)
美間 健彦 愛媛県立医療技術大学, 保健科学部, 教授 (80596437)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | Autolysin / グルコサミニダーゼ / 細胞壁 / ペプチドグリカン / 制御機構 / 溶菌酵素 / ウエルシュ菌 |
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| Outline of Research at the Start |
細菌細胞壁のペプチドグリカン（PG）は、細菌の形態を維持するために必須の構造であるが、分裂する際には自己溶菌酵素（PG分解酵素）による分解が行われなければならない。一方、PGの崩壊は即「死」を意味することから、PGの分解は厳密に制御される必要がある。私たちは、ウエルシュ菌の自己溶菌酵素Acpのタンパク質レベルでの制御機構として、PGの架橋度の違いによりCWBDのPGへの結合が変化し、それに伴いCDによるPG分解活性が制御されるという全く新しいPG分解制御機構を提唱している。本研究では、Acpについて変異体による解析、構造解析、in silico解析を行い、この新規制御機構を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細菌の形態を維持するために必須である細胞壁（ペプチドグリカン）の再構成におけるAutolysinによるペプチドグリカン分解制御機構をウエルシュ菌のAutolysin (Acp)を用いてタンパク質レベルで明らかにするものである。Acpは、N末端に10個の細胞壁結合ドメイン（CWBD）とC末端にグルコサミニダーゼドメインを持つAutolysinである。まず、10個のCWBDに関して様々な変異体を発現するベクターを構築しCWBDの数による細胞壁再構築に与える影響を調べることを目的とした。今回、構築したベクターが発現するAcpのCWBD変異体は、10個あるCWBDのうち、N末端から１個ずつ欠損させたもの（９種）と1個ずつ持つもの（5種）、その他2から5個のCWBD（10種）を持つものである。構築したプラスミドをAcp欠損ウエルシュ菌に導入し、野生型及び変異型Acpの発現を誘導し各種解析を行った。Western blotting及びZymographyを行った結果、全ての変異体において発現が確認され、細胞壁分解活性を有していることがわかった。なお、一部変異体においては様々な分解産物も見られたことより、変異体によっては安定性が異なることが予想された。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用いて菌の形態とAcp変異体の局在を調べた。CWBDを持たないAcp（AcpCD）を発現する変異体では、菌体が長くなっており、Acpの局在も見られなかった。CWBDを1つもしくは2つ持つAcp変異体では菌体がCWBDを持たないものに比べ短くなっていたが、明らかな局在は見られなかった。さらに、CWBDを3個以上持つ変異体においては、さらに菌体が短くなり、菌のセプタと両端に明らかに局在していることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ウエルシュ菌のAutolysinであるAcpに関して、ペプチドグリカン分解制御機構に対するCWBDの影響を調べるため、24種類の変異体を発現するベクターの構築ができた。さらに、これらをAcp遺伝子欠損ウエルシュ菌に導入し、その発現や細胞壁分解活性を確認するとともに、菌の形態および変異Acpの局在を明らかにした。これらの実験は、2023年度に予定していた実験であるため進歩状況としてほぼ予定通り進行していると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
AcpのCWBDに関して、ペプチドグリカンとのドッキングモデルをin silicoで構築を行い、結合に関与するアミノ酸を予想する。さらに、予想されたアミノ酸を変異させたAcpを作成し、結合活性を測定し、結合に関与するアミノ酸を同定する。一方でCWBDは、そのアミノ酸配列により5種類に分けられる。6番目のCWBDは、NMRによりその構造が決定されているが、アミノ酸配列の異なる1、２，３、１０番目のCWBDは、構造予測の段階である。したがって、これら構造未決定のCWBDに関しても構造を決定する。
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