| Project/Area Number |
23K18250
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 51:Brain sciences and related fields
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| Research Institution | Kindai University (2024)
Hokkaido University (2023) |
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Principal Investigator |
竹内 雄一 近畿大学, 薬学部, 教授 (70588384)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
真栄城 正寿 北海道大学, 工学研究院, 准教授 (40744248)
上阪 直史 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (70597624)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | 超音波 / ソノポレーション / 微小気泡 / 遺伝子導入 / ゲノム編集 / 経頭蓋集束超音波 / マイクロバブル / 脂質ナノ粒子 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究の目的は、頭蓋外から脳部位特異的な遺伝子導入およびゲノム編集を可能にする経頭蓋遺伝子操作法の創出である。経頭蓋集束超音波照射法、血液脳関門一時開放法、超音波細胞膜穿孔法、およびゲノム編集法の融合により、非侵襲性と空間特異性を両立した遺伝子導入およびゲノム編集を行う。超音波感受性機械受容チャネル遺伝子の経頭蓋導入等により、経頭蓋的神経活動操作も達成する。こうして従来法では成し得なかったオール非侵襲パイプラインで経頭蓋的神経活動操作およびゲノム編集を達成することで、薬物抵抗性脳疾患の革新的治療法の概念実証を達成する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
薬物抵抗性脳疾患の制御には、神経活動の直接操作や遺伝子治療が有効である。これまで光遺伝学的神経活動操作で脳疾患モデル動物の症状を制御する研究が多く行われてきた。しかしながら光遺伝学的神経活動操作法には光ファイバーの脳実質への刺入が必要であるため、臨床応用にはその侵襲性が大きな課題であった。
また近年脳疾患を含む遺伝病の治療法としてゲノム編集技術が着目されている。現在の治療戦略はウイルスベクターの全身投与あるいは脳実質への直接投与であるため、空間特異性の欠如あるいは侵襲性がそれぞれ課題である。
そこで本研究では、経頭蓋集束超音波照射法と超音波細胞膜穿孔（ソノポレーション）法およびゲノム編集法の融合により、頭蓋外から非ウイルス性に脳部位特異的な遺伝子導入あるいはゲノム編集を可能にする経頭蓋遺伝子操作法の創出によって、これらの課題を克服することを目的とする。
2024度は、経頭蓋集束ソノポレーション法に関して1～10 MHzの中心周波数を検討し、周波数依存的に遺伝子導入の空間的範囲を制御できることを見出し、当該遺伝子導入が神経細胞に選択的であることも見出した。また培養ヒト非神経細胞（HEK293）において、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミドを用いた任意の遺伝子を標的にしたゲノム編集を成功させた。さらにマウス由来培養ニューロブラストーマ細胞（Neuro2a）において、ゲノム編集を評価する実験系を立ち上げた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究遂行に際して重要な技術的課題である「経頭蓋集束超音波照射法とソノポレーション法による脳部位特異的かつ非侵襲的な遺伝子導入」を既に達成できているため。そのため「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度までに、プラスミドベクターおよび微小気泡の静脈投与と経頭蓋集束超音波照射法とを組み合わせることで、脳部位特異的かつ非侵襲的な遺伝子導入法の創出に成功するとともに、ゲノム編集の実験系の立ち上げにも成功した。2025年度は、当該成果を発展させ、経頭蓋集束ソノポレーション法による遺伝子導入の効率向上、超音波遺伝学素子の経頭蓋的強制発現系の開発、および疾患モデル動物からの疾患神経細胞採取を想定した、マウス大脳神経細胞の初代培養実験系を構築する。
1. 経頭蓋集束ソノポレーション法による遺伝子導入の効率向上：超音波照射の物理的パラメーター（照射出力、デューティ比等）の検討や核酸封入脂質ナノ粒子を導入することで、経頭蓋集束ソノポレーション法による遺伝子導入の効率向上を検討する。
2. 超音波遺伝学素子の経頭蓋的強制発現系の開発：代表的な超音波遺伝学素子である機械受容チャネルPiezoおよびTRP分子を大脳神経細胞に非侵襲的かつ細胞種特異的に導入する技術を開発する。プラスミドのソノポレーションで、アデノ随伴ウイルスベクターに搭載不可能な大サイズ遺伝子の導入が可能になる。神経細胞やグリア細胞に特異的なプロモーターの利用で細胞種特異性を実現する。
3. ソノポレーション技術を介したゲノム編集の効率改善を目的としたマウス大脳神経細胞の初代培養実験系の構築：2024年度までに立ち上げた培養細胞系を、遺伝的てんかんや認知症モデルマウスの疾患細胞をソノポレーション技術を介したゲノム編集技術で、in vitro遺伝子治療を評価可能な系に発展させる。具体的には、まず野生型のマウスの大脳神経細胞の初代培養系を立ち上げ、初代培養マウス大脳神経細胞に、Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミド、ガイドRNA、およびレポーター遺伝子発現鋳型DNAを導入し、その効率を評価する。
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