Low copy repeats組換えホットスポットのゲノム・エピゲノム基盤の解明

• Project/Area Number: 23K18278
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 52:General internal medicine and related fields
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 水口 剛 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (90404996)
• Project Period (FY): 2023-06-30 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2024: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2023: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: Low copy repeats / ソトス症候群 / ロングリードシーケンス / DNAメチル化 / ゲノム高次構造

Outline of Research at the Start

ソトス症候群の一部はLow copy repeats (LCRs)を介したNSD1遺伝子領域の欠失により引き起こされる。欠失の発生に影響を及ぼす因子としてLCRsのサイズ、相同性、LCRs間の距離（ゲノム1次配列情報）が知られている。ゲノム1次配列情報以外の修飾因子の存在も示唆されているが詳細は不明である。一方、ゲノム技術の進歩により、これまで解析が困難であったリピート領域の高精度なゲノム・エピゲノム解析が可能となってきた。そこで本課題では新規ゲノム解析技術を駆使してソトス症候群LCRsの特徴を明らかにし組換えホットスポットの分子機構の解析基盤を提供する事を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

ソトス症候群におけるLow copy repeats (LCRs)を介したNSD1遺伝子領域の欠失の多くは父由来染色体から発生する事が報告されているが、この親由来の偏りの分子基盤は不明である。「父の染色体において欠失の誘因となる特徴的なゲノム構造、メチル化異常、ゲノム高次構造が存在するか」という仮説を検証するため下記の研究項目を実施した。
(1) 相決定：患者・両親（トリオ）由来のゲノムDNAを用いてロングリードシーケンスを実施した。Hiphaseを用いた相決定を行った（phase blockの平均240kb, Max 3.4Mb）。またread depthを用いたCNV解析により、これまでロングリードのStructural Variant解析で検出できなかった1Mbを超えるサイズのNSD1遺伝子を含む5q35領域の欠失を検出し父親由来の欠失を塩基レベルで確認することに成功した。
(2) LCRsの区別：平均リード長が10kbを超えるロングリードシーケンスを用いてもLCRs領域の解析は困難を極める。Monarch HMW DNA Extraction Kitにより抽出した高分子量ゲノムDNAをinputとしてultra-long DNAシークエンス (ONT PromethION)を実施した。通常のプロトコールに比較して長いリード長を達成したが[リード長 平均42 kb, Max 822 kb (ultra-long) vs 平均15 Kb, Max411 kb (通常解析の平均)]、一方で出力が通常の1/3以下に減少した[30 Gb (ultra-long) vs 104 Gb (通常解析の平均)] 。
(3) DNAメチル化：（１）（２）で得られたデータについてJasmine, Guppyを使用したメチル化検出を行い、2本の染色体を区別したDNAメチル化解析が可能となった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画通り、ソトス症候群の5q35領域欠失症例についてトリオベース（患者・両親）でロングリードシーケンスを行い、相決定・DNAメチル化・LCRs領域解析のワークフローを確立できた。この解析により、これまで塩基レベルで解析が困難とされたLCRs領域を含む5q35領域についてハプロタイプを区別したゲノム・DNAメチル化解析が可能であることが確認できた。当初LCRs領域を十分に長いリード長で解析するために、ultra-long DNAシークエンスが必要ではないかと考えていたが、高分子量DNAのハンドリングが容易ではなく、再現性をもって解析に十分な出力（30×カバレッジ）得ることが難しいことが分かった。更にultra-long DNAシークエンスと通常プロトコールの解析結果を比較したところ、5q35領域（LCRs含む）の解析には通常プロトコールで十分であることが明らかにできた。一方で検証に時間がかかったため、想定解析数を下回っている。

Strategy for Future Research Activity

健康な両親を含めたトリオ検体のDNAと細胞株の樹立を継続し、トリオベースのロングリードシークエンスを行う。5q35領域（LCRs含む）の解析には通常プロトコールで十分であることがわかったので、ultra-long DNAシークエンスではなく通常プロトコールを採用することにする。得られたデータについて1年目に構築した解析系を用いてゲノム構造・DNAメチル化の差異を検討する。また2年目以降に計画していたゲノム高次構造解析系についても構築を試みる。

Research Products

• [Journal Article] Whole-exome sequencing reveals causative genetic variants for several overgrowth syndromes in molecularly negative Beckwith-Wiedemann spectrum (2024)
  • Author(s): Higashimoto K., Sun F., Imagawa E., Saida K., Miyake N., Hara S., Yatsuki H., Kubiura-Ichimaru M., Fujita A., Mizuguchi T., Matsumoto N. and Soejima H.
  • Journal Title: J Med Genet Volume: NA Issue: 6 Pages: 590-594
  • DOI: 10.1136/jmg-2023-109621
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel compound heterozygous ABCA2 variants cause IDPOGSA, a variable phenotypic syndrome with intellectual disability (2024)
  • Author(s): Inoue Y., Tsuchida N., Kim C. A., de Oliveira Stephan B., Castro M. A. A., Honjo R. S., Bertola D. R., Uchiyama Y., Hamanaka K., Fujita A., Koshimizu E., Misawa K., Miyatake S., Mizuguchi T. and Matsumoto N.
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 69 Issue: 3-4 Pages: 163-167
  • DOI: 10.1038/s10038-024-01219-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Detection of hidden intronic DDC variant in aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency by adaptive sampling (2024)
  • Author(s): Koshimizu E., Kato M., Misawa K., Uchiyama Y., Tsuchida N., Hamanaka K., Fujita A., Mizuguchi T., Miyatake S. and Matsumoto N.
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 69 Issue: 3-4 Pages: 153-157
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01217-2
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Case report: Neuronal intranuclear inclusion disease initially mimicking reversible cerebral vasoconstriction syndrome: serial neuroimaging findings during an 11-year follow-up (2024)
  • Author(s): Lee G. H., Jung E., Jung N. Y., Mizuguchi T., Matsumoto N. and Kim E. J.
  • Journal Title: Front Neurol Volume: 15 Pages: 1347646-1347646
  • DOI: 10.3389/fneur.2024.1347646
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Abnormal axonal development and severe epileptic phenotype in Dynamin-1 (DNM1) encephalopathy (2024)
  • Author(s): Matsubara K., Kuki I., Ishioka R., Yamada N., Fukuoka M., Inoue T., Nukui M., Okamoto N., Mizuguchi T., Matsumoto N. and Okazaki S.
  • Journal Title: Epileptic Disord Volume: 26 Issue: 1 Pages: 139-143
  • DOI: 10.1002/epd2.20181
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A female case of L1 syndrome that may have developed due to skewed X inactivation (2024)
  • Author(s): Mori T., Nakano M., Tayama T., Goji A., Toda Y., Kameyama S., Mizuguchi T., Urushihara M. and Matsumoto N.
  • Journal Title: Brain Dev Volume: NA Issue: 6 Pages: 230-233
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2024.03.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A heterozygous germline deletion within USP8 causes severe neurodevelopmental delay with multiorgan abnormalities (2024)
  • Author(s): Sakamoto M., Kurosawa K., Tanoue K., Iwama K., Ishida F., Watanabe Y., Okamoto N., Tsuchida N., Uchiyama Y., Koshimizu E., Fujita A., Misawa K., Miyatake S., Mizuguchi T. and Matsumoto N.
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 69 Issue: 2 Pages: 85-90
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01209-2
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel missense variants cause intermediate phenotypes in the phenotypic spectrum of SLC5A6-related disorders (2024)
  • Author(s): Utsuno Y., Hamada K., Hamanaka K., Miyoshi K., Tsuchimoto K., Sunada S., Itai T., Sakamoto M., Tsuchida N., Uchiyama Y., Koshimizu E., Fujita A., Miyatake S., Misawa K., Mizuguchi T., Kato Y., Saito K., Ogata K. and Matsumoto N.
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 69 Issue: 2 Pages: 69-77
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01206-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Long-read sequencing revealing intragenic deletions in exome-negative spastic paraplegias (2023)
  • Author(s): Fukuda H., Mizuguchi T., Doi H., Kameyama S., Kunii M., Joki H., Takahashi T., Komiya H., Sasaki M., Miyaji Y., Ohori S., Koshimizu E., Uchiyama Y., Tsuchida N., Fujita A., Hamanaka K., Misawa K., Miyatake S., Tanaka F. and Matsumoto N.
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 68 Issue: 10 Pages: 689-697
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01170-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Three KINSSHIP syndrome patients with mosaic and germline AFF3 variants (2023)
  • Author(s): Inoue Yuta、Tsuchida Naomi、Okamoto Nobuhiko、Shuichi Shimakawa、Ohashi Kei、Saitoh Shinji、Ogawa Atsushi、Hamada Keisuke、Sakamoto Masamune、Miyake Noriko、Hamanaka Kohei、Fujita Atsushi、Koshimizu Eriko、Miyatake Satoko、Mizuguchi Takeshi、Ogata Kazuhiro、Uchiyama Yuri、Matsumoto Naomichi
  • Journal Title: Clinical Genetics Volume: 103 Issue: 5 Pages: 590-595
  • DOI: 10.1111/cge.14292
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NOTCH2NLC GGC Repeat Expansion in Patients With Vascular Leukoencephalopathy (2023)
  • Author(s): Liao Y. C., Wei C. Y., Chang F. P., Chou Y. T., Hsu S. L., Chung C. P., Mizuguchi T., Matsumoto N., Yet S. F. and Lee Y. C.
  • Journal Title: Stroke Volume: 54 Issue: 5 Pages: 1236-1245
  • DOI: 10.1161/strokeaha.122.041848
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Complete SAMD12 repeat expansion sequencing in a four-generation BAFME1 family with anticipation (2023)
  • Author(s): Mizuguchi T., Toyota T., Koshimizu E., Kameyama S., Fukuda H., Tsuchida N., Uchiyama Y., Hamanaka K., Fujita A., Misawa K., Miyatake S., Adachi H. and Matsumoto N.
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 68 Issue: 12 Pages: 875-878
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01187-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A case of epilepsy with myoclonic atonic seizures caused by SLC6A1 gene mutation due to balanced chromosomal translocation (2023)
  • Author(s): Mori Tatsuo、Sakamoto Masamune、Tayama Takahiro、Goji Aya、Toda Yoshihiro、Fujita Atsushi、Mizuguchi Takeshi、Urushihara Maki、Matsumoto Naomichi
  • Journal Title: Brain and Development Volume: － Issue: 7 Pages: 395-400
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2023.03.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biallelic structural variations within FGF12 detected by long-read sequencing in epilepsy (2023)
  • Author(s): Ohori S., Miyauchi A., Osaka H., Lourenco C. M., Arakaki N., Sengoku T., Ogata K., Honjo R. S., Kim C. A., Mitsuhashi S., Frith M. C., Seyama R., Tsuchida N., Uchiyama Y., Koshimizu E., Hamanaka K., Misawa K., Miyatake S., Mizuguchi T., Saito K., Fujita A. and Matsumoto N.
  • Journal Title: Life Sci Alliance Volume: 6 Issue: 8 Pages: e202302025-e202302025
  • DOI: 10.26508/lsa.202302025
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A novel homozygous CHMP1A variant arising from segmental uniparental disomy causes pontocerebellar hypoplasia type 8 (2023)
  • Author(s): M. Sakamoto, T. Shiiki, S. Matsui, N. Okamoto, E. Koshimizu, N. Tsuchida, Y. Uchiyama, K. Hamanaka, A. Fujita, S. Miyatake, K. Misawa, T. Mizuguchi and N. Matsumoto
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 68 Issue: 4 Pages: 247-253
  • DOI: 10.1038/s10038-022-01098-x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A missense variant at the RAC1-PAK1 binding site of RAC1 inactivates downstream signaling in VACTERL association (2023)
  • Author(s): Seyama Rie、Nishikawa Masashi、Ogata Kazuhiro、Nagata Koh-ichi、Matsumoto Naomichi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 13 Issue: 1 Pages: 9789-9789
  • DOI: 10.1038/s41598-023-36381-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Distal arthrogryposis in a girl arising from a novel TNNI2 variant inherited from paternal somatic mosaicism (2023)
  • Author(s): R. Seyama, Y. Uchiyama, Y. Kaneshi, K. Hamanaka, A. Fujita, N. Tsuchida, E. Koshimizu, K. Misawa, S. Miyatake, T. Mizuguchi, S. Makino, A. Itakura, N. Okamoto and N. Matsumoto
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 68 Issue: 5 Pages: 363-367
  • DOI: 10.1038/s10038-022-01117-x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Synchronous heart rate reduction with suppression‐burst pattern in <i>KCNT1</i> ‐related developmental and epileptic encephalopathies (2023)
  • Author(s): Yamamoto Kaoru、Baba Shimpei、Saito Takashi、Nakagawa Eiji、Sugai Kenji、Iwasaki Masaki、Fujita Atsushi、Fukuda Hiromi、Mizuguchi Takeshi、Kato Mitsuhiro、Matsumoto Naomichi、Sasaki Masayuki
  • Journal Title: Epilepsia Open Volume: － Issue: 2 Pages: 651-658
  • DOI: 10.1002/epi4.12705
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Complete SAMD12 repeat expansion sequencing in a four-generation BAFME1 family with anticipation (2023)
  • Author(s): 水口剛
  • Organizer: 第68回日本人類遺伝学会