| Project/Area Number |
23K18302
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 54:Internal medicine of the bio-information integration and related fields
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
山縣 和也 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (70324770)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
津山 友徳 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (10845960)
佐藤 叔史 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (90622598)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | 老化 / β細胞 / インスリン分泌 / エピゲノム / シングルセル解析 |
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| Outline of Research at the Start |
加齢は２型糖尿病の重要なリスク因子である。加齢に伴い、膵β細胞からのインスリン分泌が低下することが報告されているが、その分子機序は不明である。研究代表者は、加齢に伴い膵β細胞がインスリンを特異的に発現するという細胞らしさを失っていることを見出した。本研究では、老化に伴うβ細胞個性喪失の分子機構を解明し、糖尿病の新たな予防法・治療法開発のための分子基盤を確立することを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
加齢は糖尿病発症の重要な危険因子であり、６５歳以上の高齢者における糖尿病の有病率は全世界で20%を越えている。加齢に伴い膵β細胞からのインスリン分泌が低下することが高齢者における糖尿病有病率の増加に関与していると考えられている（Diabetologia 2020）が、加齢に伴いインスリン分泌が低下する理由は不明である。
マウス膵島を用いたシングルセルRNA-seq解析の結果、老齢マウス膵島では、インスリンの発現レベルが低く、グルカゴンやソマトスタチンなどβ細胞には発現しない他の膵島ホルモンを共発現するポリホルモーナルなβ細胞（β2細胞）が存在していることが判明した。FACSで単離した膵島細胞を用いた検討においても、老齢マウスではインスリンとグルカゴンの２重陽性の細胞が存在することが確認され、加齢によってインスリンを特異的に発現するという「β細胞らしさ」が失われており、そのためにインスリン分泌が低下する可能性が考えられた。
多能性幹細胞からβ細胞が分化する過程において、エンハンサー領域の変容と共にポリホルモーナルなβ細胞が出現することが報告されており（Cell Stem Cell 2020）、加齢によるエピゲノム変化がポリホルモナールなβ細胞の出現に関与している可能性が考えられた。単離膵島を用いたATAC-seq（オープンクロマチン領域の検出）並びにCUT&Tag（エンハンサー領域の検出）を実施するための条件検討を行い、老化β細胞のエピゲノム変容を解明するための基盤を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）インスリンとグルカゴンの共染色の条件確立：シングルセルRNA-seq解析の結果、老齢マウス膵島では、インスリンとグルカゴンを共発現するポリホルモーナルなβ細胞が存在していることが判明した。インスリンとグルカゴンの共発現をタンパクレベルで確認するため、膵島細胞をFACSで単離し、インスリンとグルカゴンの共染色を行う系を確立した。その結果、タンパクレベルでもインスリンとグルカゴンを共発現するβ細胞が老齢マウス膵島に存在することが確認できた。
（２）膵島細胞を用いたATAC-seqの条件検討：ATAC-seqではオープンクロマチン領域にトランスポゼースを使ってタグを導入した後、ライブラリーを増幅し、次世代シークエンスを行う。10万個の膵島細胞を用いてATAC-seqを実施する条件を確立することに成功した。
（３）膵島細胞を用いたCUT&Tagの条件検討：CU&Tag解析では、プロテインAとトランスポザーゼを使用することでH3K27アセチル陽性のエンハンサー領域にシーケンスアダプターを選択的に挿入する必要がある。1万個の膵島細胞を用いて、CUT&Tagを実施するための抗体の反応条件やタグメンテーションの条件を決定することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）経時的なシングルセルRNA-seq解析を実施し、ポリホルモーナルなβ細胞がいずれの時期から出現するか明らかにする。
（２）ポリホルモーナルなβ細胞では細胞表面分子である糖輸送担体GLUT2の発現が低下している。GLUT2抗体を用いてβ2細胞を単離・濃縮する条件検討を行う。
（３）単離したβ2細胞を用いてATAC-seqおよびCUT&Tagを実施し、加齢によるエンハンサー領域の変容を明らかにする。老化で変容が認められたエンハンサー領域内の結合モチーフ探索や遺伝子発現クラスタリングを実施することで、ポリホルモーナルなβ細胞の出現を制御するコア転写遺伝子群を同定する。
（４）コア遺伝子の強制発現やノックダウンを行い、機能解析を行う。
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