| Project/Area Number |
23K18326
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 56:Surgery related to the biological and sensory functions and related fields
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
山北 由彦 名古屋大学, 医学系研究科, 客員研究者 (70639583)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
梶山 広明 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (00345886)
吉原 雅人 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (00878374)
富田 弘之 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (50509510)
小屋 美博 名古屋大学, 医学系研究科, 特任講師 (80396960)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
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| Keywords | 卵巣癌 / CAR-T療法 / 腹水 / 卵巣がん / 癌性腹膜炎 |
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| Outline of Research at the Start |
「キメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞療法」（CAR-T療法）が実用化され、造血器腫瘍における劇的な治療効果から大きな注目を集めている。しかしながら固形腫瘍におけるCAR-T療法の治療効果は限定的であり、治療法の更なる改善が求められている。特に卵巣がん患者の腹腔内環境は、高度に免疫抑制状態にあることが報告されており、その要因の一つにがん性腹膜炎に伴う腹水の存在が挙げられる。本研究ではヒト臨床検体サンプルとゲノム編集技術を用いた機能遺伝子のゲノムワイドスクリーニング法を用いて、免疫抑制環境を解除する遺伝子を同定し、卵巣がんの腹腔内微小環境において有効な新規CAR-T遺伝子改変手法を開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor; CAR）を応用した「キメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞療法」（CAR-T療法）が実用化され、造血器腫瘍における劇的な治療効果から大きな注目を集めている。しかしながら固形腫瘍におけるCAR-T療法の治療効果は限定的であり、治療法の更なる改善が求められている。特に卵巣がん患者の腹腔内環境は、高度に免疫抑制状態にあることが報告されており、その要因の一つにがん性腹膜炎に伴う腹水の存在が挙げられる。つまりCAR遺伝子導入によりT細胞の抗腫瘍能強化を行ったとしても、がん性腹水が存在する難治性卵巣がん患者の腹腔内では、その傷害活性が高度に消失してしまうと考えられる。本研究では、難治性の進行・再発卵巣がんでの腹腔内免疫抑制環境を突破する新しいCAR-T細胞療法の創成を目的とする。
本研究ではヒト臨床検体サンプルとゲノム編集技術を用いた機能遺伝子のゲノムワイドスクリーニング法とを用いて、免疫抑制環境を解除する遺伝子を同定し、卵巣がんの腹腔内微小環境において有効な新規CAR-T遺伝子改変手法を確立する。具体的にはヒト19,050遺伝子に対するsgRNAがデザインされたCRISPR/Cas9プールライブラリーシステム (human Genome-Scale CRISPR Knock-Out (GeCKO)) を利用して多種の遺伝子をノックアウトしたT細胞及びCAR-T細胞を調整し、それらに卵巣がん患者由来の腹水を投与することで、抑制状態を突破して機能する細胞を抽出、当該細胞群に濃縮されたsgRNA配列を指標に機能遺伝子を同定する。同定した機能遺伝子から候補遺伝子の絞り込み、それらをノックアウトしたCD19及び抗MSLN CAR-T細胞を作製して、卵巣がん腹膜播種モデルマウスにおいて薬効・動態の評価を行い、その有用性を検証する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究により、以下の内容に関する検討を行った。
ヒト19,050遺伝子に対するsgRNAがデザインされたCRISPR/Cas9プールライブラリーシステム (GeCKO)を作成した。遺伝子の大量増幅を完了し、均一な状態であることをNGS解析にて確認した。またスクリーニング用の細胞集団として抗MSLN CAR-T細胞の作成を行い、スクリーニングに向けた条件検討を実施している。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記CAR-T細胞にGeCKO sgRNAライブラリーレンチウイルスを感染させ、スクリーニング用細胞集団を取得する。この際に1細胞あたりsgRNAが複数導入されないように、sgRNAレンチウイルスベクターのMOIを0.3以下に調製して感染させる。活性化の抑制のために数日培養を行った後、セルソーターによって6,000万個の活性化細胞を取得する。ゲノムDNAを抽出することで、NGS解析を行うためのテンプレートとする。作製したテンプレート及び指定されたPCRプライマーを用いてNGSライブラリーを調製する。詳細な手順については、ブロード研究所が公表しているプロトコールに準じて行い、イルミナ社のHi-SeqあるいはNova-Seqによって、シークエンスリードを取得する。得られたリード配列のRIGER分析から、候補遺伝子を取得する。得られた候補遺伝子の文献調査を行い、新規性のある因子から順位付けされた遺伝子に対して複数のsgRNAを設計し機能解析を行う。
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