Elucidation of the mechanism of sperm fibrous sheath formation using a heterotopic model

Research Project

Project/Area Number	23K18328
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 56:Surgery related to the biological and sensory functions and related fields
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	宮田治彦大阪大学, 微生物病研究所, 准教授 (50604732)
Project Period (FY)	2023-06-30 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2025: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000) Fiscal Year 2024: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	鞭毛 / 繊維鞘 / 精子運動性 / 男性不妊
Outline of Research at the Start	日本を含む先進諸国では6組に1組の夫婦が不妊に悩んでいるとされ、少子高齢化が進む中、不妊症は重大な社会問題となっている。精子鞭毛の大部分を占める主部には繊維鞘と呼ばれる構造体が存在する。繊維鞘は精子の運動性や受精能に非常に重要な構造体であるが、その形成機構は不明である。最近、繊維鞘形成の起点となる縦支柱が異所に形成される遺伝子改変マウスを作製した。本研究では、この遺伝子改変マウスの解析を足掛かりに、長年不明である繊維鞘形成機構の解明に挑む。
Outline of Annual Research Achievements	2023年度は、Afs1 (abnormal fibrous sheath 1) ノックアウト (KO) マウスの解析を行った。このKOマウスの精子では、繊維鞘形成の起点となる縦支柱が異所に形成される。まずは精子運動解析システム (CASA) を用いて精子の運動性を詳細に解析したところ、Afs1 KOマウスでは精子の運動率や運動速度の各種パラメーターが有意に低下していた。また、体外受精を行ったところ、Afs1 KO精子は卵子と受精しなかった。卵子の周りにある卵丘細胞の層を取り除いても、Afs1 KO精子は卵子と受精しなかった。一方、同じく卵子の周りにある透明帯を取り除くと、Afs1 KO精子でも卵子と受精することができた。よって、Afs1 KO精子は卵子透明帯を通過することができないと考えられる。続いて、FLAGタグとビオチンリガーゼであるTurboIDが付加されたAFS1を発現するトランスジェニック (TG) マウスを作製した。このトランスジーンは、Afs1 KOマウスの生殖能力や精子運動性をレスキューすることができた。FLAG抗体を用いて、TGマウスの精巣切片の免疫染色を行ったところ、縦支柱が形成される時期の鞭毛にAFS1-FLAG-TurboIDが局在していることが分かった。一方で、精子形成後期にはAFS1-FLAG-TurboIDが鞭毛から消失していた。さらに、免疫電子顕微鏡法を用いてAFS1-FLAG-TurboIDの局在を解析したところ、精巣切片の免疫染色と同様の結果が得られた。AFS1-FLAG-TurboIDは縦支柱が形成される位置の微小管を含む、周辺微小管付近に局在していた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason Afs1 KO精子は運動性低下のために透明帯を通過できないことが分かった。この精子運動性の低下は、Afs1のトランスジーンでレスキューすることができた。さらに、このTGマウスを用いてAFS1の局在を調べたところ、縦支柱の形成時期と一致することも分かった。
Strategy for Future Research Activity	AFS1-FLAG-TurboID のTGマウスを用いて解析を行う。まずは、FLAG抗体を用いてAFS1-FLAG-Turbo1の免疫沈降を行い、質量分析によってAFS1と相互作用するタンパク質を探索する。また、このTGマウスではAFS1にビオチンリガーゼであるTurboIDが付加されている。そこで、TＧマウスにビオチンを投与することによってAFS1に近接するタンパク質をビオチン化し、質量分析を用いてビオチン化されたタンパク質を同定する。