| Project/Area Number |
23K18366
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 57:Oral science and related fields
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
小林 真之 日本大学, 歯学部, 教授 (00300830)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾崎 弘展 同志社大学, 脳科学研究科, 准教授 (30747697)
中谷 有香 日本大学, 歯学部, 講師 (60781391)
加藤 成樹 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (90443879)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
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| Keywords | 島皮質 / ケミカルジェネティクス / 口腔顔面痛 / c-Fos |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は，他の感覚と比較して大幅に立ち後れている痛みの記憶の座について，対象を口腔顔面痛に絞って探索するものであり，口腔顔面領域における慢性痛を惹起する痛みの記憶の座が島皮質に存在するという仮説を検証する。そのために，c-Fosをマーカーとして口腔顔面痛に応答する島皮質ニューロンを同定し，ケミカルジェネティクスを用いて同ニューロンを選択的に制御して痛み関連行動を定量化する。すなわち，口腔顔面領域での侵害受容に関与する島皮質ニューロンを選択的に活性化もしくは抑制して，侵害刺激によって生じる逃避行動を制御できるか検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和５年度は，本研究では，ケミカルジェネティクスを用いて口腔顔面痛に特異的に応答する島皮質ニューロンを選択的に活性化もしくは抑制する技術を確立し，それらを制御することによって生じる痛み関連行動を定量化するべく，以下の2つの実験を行った。
Ⅰ．ディープラーニングを利用したアルゴリズムによる行動解析プログラムの開発：
抑制性ニューロンに緑色蛍光タンパクを発現させたVGAT-Venusラットのヒゲ部へカプサイシンを注入すると，顔面を前肢でなでる特徴的かつ定型的な行動（顔面ひっかき行動）が誘発される。そこで，疼痛刺激による顔面ひっかき行動の定量化を，実験者の主観が入らない人工ニューラルネットワークによる機械学習（DeepLabCut（R)）を用いて行った。その結果，ビデオレート（３０Hz）での記録ではひっかき行動を定量化できず，フレームレートをさらに上げる必要があることが明らかになった。そこで，現在，６０Hzのフレームレートでの記録設備を構築中である。
Ⅱ．c-Fos陽性細胞へのhM3DｑおよびhM4Diの選択的発現方法の確立：
島皮質にAAV-FOS::CreERT2に加えてAAV-hSyn::DIO-hM3Dq-mCherryもしくはAAV-hSyn::DIO-hM4Di-mCherryを注入し，c-Fos陽性ニューロンのみにhM3DqもしくはhM4Diを発現させる手法を確立するため，プラスミドからウイルスベクターを作製した。感染する細胞への選択性を上げるため，AAVのセロタイプとしてはAAV2を選択した。現在，同ベクターを1:100または1:500の割合で混和した懸濁液を島皮質に注入し，ニューロンに感染しているか否かを評価中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ウイルスベクターの作製まで到達し，ケミカルジェネティクスによる実験を開始したので，今のところ順調と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ⅰ．c-Fos陽性細胞の選択的活性化が痛み関連行動に及ぼす影響の解析
最適なベクターの混和率を決定した後に，AAV-FOS::CreERT2とAAV-hSyn::DIO-hM3Dq-mCherryを感染させたラットにタモキシフェンを投与した後，CNOを髄腔内投与し，島皮質c-Fos陽性ニューロンを特異的に活性化させる。その結果生じる顔面ひっかき行動について，ディープラーニングを利用したアルゴリズムによる行動解析プログラムを用いて定量化し，島皮質痛み関連ニューロンの選択的活性化によって痛み行動が惹起されるか検証する。
Ⅱ．c-Fos陽性細胞の選択的抑制が痛み関連行動に及ぼす影響の解析
AAV-FOS::CreERT2とAAV-hSyn::DIO-hM4Di-mCherryを注入したラットの上顎神経を部分結紮し，神経障害性疼痛を生じさせる。モデル動物が確かに神経障害性疼痛モデルになっているか否かについて，解析する。3週間後，タモキシフェン投与後にCNOを注入し，島皮質c-Fos陽性ニューロンを特異的に抑制する。自発性に生じる顔面ひっかき行動を定量化し，島皮質痛み関連ニューロンの選択的抑制によって痛み行動が抑制されるか検証する。
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