| Project/Area Number |
23K19291
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
0602:Agricultural and environmental biology and related fields
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
直井 崇 弘前大学, 農学生命科学部, 助教 (30965835)
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| Project Period (FY) |
2023-08-31 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | トマト / ゲノム編集 / VIGS / アグロバクテリウム / DCL2b / DCL2d / DCL4 / PDS / ウイロイド / 耐病性 / RNAサイレンシング / DCL |
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| Outline of Research at the Start |
トマトでは、RNAサイレンシングの重要因子であるDCL2と4がジャガイモやせいもウイロイド(PSTVd)に対する耐病性の発揮と蓄積の抑制に重要であり、耐病性品種では感染初期のPSTVdの蓄積が低く維持される。本研究では、PSTVd感染初期に罹病性または耐病性トマト品種で特異的に発現が上昇するDCL2b及びDCL2d、またはDCL4を、ゲノム編集技術により個別にノックアウトしたトマト系統を作出・選抜する。そして耐病性とPSTVdの初期蓄積、及び発病関連遺伝子の発現におけるDCLノックアウトの影響を逆遺伝学的に解析することで、PSTVd耐病性における各DCLの役割とその発病抑制機構を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
R5年度は、まずゲノム編集用バイナリーベクターpDeCas9をベースに、グルホシネート耐性遺伝子発現カセットをカナマイシン耐性遺伝子NPTII発現カセットに組換えたpDeCas9-KanRを作製した。次にウェブツールのCRISPR-Pを利用してトマトのDCL4、DCL2b、及びDCL2d遺伝子をゲノム編集するためのガイドRNA配列を決定した。これらのガイドRNA配列を含むオリゴDNA断片をpEn-Chimeraへクローニングした。そしてGatewayクローニングによりガイドRNA＋Scaffold RNA (Cas9の足場となる配列) の発現カセットをpDeCas9-KanRへ移し替えた3つのゲノム編集用コンストラクトを作製した。
次にウイルスベクターにより一過的にDCL遺伝子の発現を抑制 (ノックダウン) する実験系 (Virus-induced gene silencing; VIGS) の検討を行った。まずトマトのフィトエンディサチュラーゼ (PDS) mRNAの部分配列を含むcDNA断片をタバコ茎えそウイルス (TRV) ゲノムRNA２発現ベクターへクローニングしたpTRV2-SlPDSi_ASを作製した。そしてこのベクターとTRVゲノムRNA1発現ベクターをそれぞれアグロバクテリウムLBA4404株にエレクトロポレーション法で導入、選抜薬剤を含むLB培地で培養後、接種源調整に用いた。そしてトマト (品種Rutgers及びMoneymaker) の本葉への接種源のインフィルトレーションまたはスプレー散布、または主茎への接種源の注入によりアグロバクテリウムを接種した。その結果、注射により接種源を注入した場合に最もTRVの感染効率が高く (10/10)、接種後10-12日頃にPDS遺伝子の発現抑制を示す葉の白色化が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
R5年度はゲノム編集用バイナリーベクターを作製しDCL遺伝子をノックアウトしたトマト系統の作出・選抜に取り掛かる予定であったが、トマトの形質転換の予備試験で使用していたアグロバクテリウムLBA4404株がトマトへの感染及び形質転換効率があまり高くなかったため、現在使用するアグロバクテリウム株の種類や濃度、接種時間等の条件検討を実施している段階である。その一方で、TRVベクターを用いた一過的遺伝子発現抑制系に関しては前述の通り条件検討が完了しており、当初の予定通り進行している。さらにトマトのDCL2b及びDCL2d mRNAの部分配列を含むキメラcDNA断片またはDCL4 mRNAの部分配列を含むcDNA断片をTRVゲノムRNA２発現ベクターへクローニングしたpTRV2-SlDCL2i_AS及びpTRV2-SlDCL4i_ASの作製も完了している。
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| Strategy for Future Research Activity |
R6年度は、R5年度に引き続きトマトの形質転換の条件検討を実施する。具体的には、トマトの形質転換で実績のあるアグロバクテリウムGV2260株を使用し、トマト品種Rutgers及びMoneymakerにおける最適な形質転換条件を検討する。その後、各DCL遺伝子のゲノム編集トマト系統の作出・選抜を開始する予定である。また作製したTRVベクターを用いてDCL2またはDCL4の発現を一過的に抑制したトマト (品種Rutgers及びMoneymaker) にジャガイモやせいもウイロイド (PSTVd) を接種する。そして、各DCL遺伝子の発現抑制が各トマト品種のPSTVd感受性 (または耐病性) へ及ぼす影響を評価する。
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