| Project/Area Number |
23K19356
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
0701:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
有吉 純平 神戸薬科大学, 薬学部, 助手 (30832620)
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| Project Period (FY) |
2023-08-31 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | miRNA / バイオマーカー / 蛍光プローブ / 空間トランスクリプトーム / mRNA |
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| Outline of Research at the Start |
空間トランスクリプトームは細胞や組織のmRNAを空間的に解析する新技術であり、疾患の診断や治療戦略の策定、細胞の機能解析に革命的な進展をもたらす次世代の解析技術として急速な発展を見せている。しかし、使用される核酸プローブの設計は通常、天然型DNAで構成されているため核酸分解酵素耐性が低く、生体内での応用が難しい。また、オフターゲットのリスクから対象はmRNAに限られる。本研究では、非環状型骨格核酸を用いて新しい核酸プローブを設計する。これにより、miRNAのハイマルチプレックス検出法を開発し、空間トランスクリプトームの適用範囲を拡大することを目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
(I) 非環状型人工核酸からなるmiRNA検出プローブの開発 (原理検証実験)
原理検証用の実験として、microRNA21(miR-21)を標的とした30塩基長のDNAプローブ、SNAプローブ、L-aTNAプローブを合成した。これらのモデル配列とmiR21の結合親和性を紫外可視分光光度計を用いて測定した。その結果、DNAプローブおよびL-aTNAプローブは安定的に標的と結合したが、SNAプローブは結合しないことが示された。融解温度曲線からSNAプローブは自分自身で安定的な構造を取ることが示されたため、一次プローブの設計にはL-aTNAを採用した。蛍光色素を5'末端に付加したL-aTNA型検出プローブ(補足プローブ)を設計し、安定的に一次プローブと結合することを確認した。
(II) オフターゲットリスクの低いハイマルチプレックスmiRNA検出システムの構築
前項で基本的なプローブの設計は行えたので、ハイマルチプレックス化を目指したプローブの設計を行った。試験的に合成した長鎖の一次プローブではmiR-21および蛍光プローブと問題なく結合していることを確認しているが、各ステップでの蛍光色素の消光が十分に行えていない点は課題として挙げられる。
(III) 検出感度向上のためのSample Prep.法の検討
一次プローブの配列と相補的で、末端にメタクリル基を修飾した固定化プローブを合成した。今後はHeLa細胞等に一次プローブと補足プローブを添加した後にアクリルアミドゲルで包埋し、miRNAの固定化が可能かどうかを評価していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は新規研究室立ち上げのため、実験にまつわる装置や体制を整えるために想定よりも長い時間を要したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
(I) 非環状型人工核酸からなるmiRNA検出プローブの開発 (原理検証実験)
蛍光プローブの鎖長をより短くデザインすることで、一次プローブ検出ステップ数を増やせるように配列を最適する。
(II) オフターゲットリスクの低いハイマルチプレックスmiRNA検出システムの構築
蛍光色素の消光ステップに課題が残るため、還元的環境下で切断される-S-S-結合をプローブに組み込み、各ステップで還元剤を用いることで蛍光色素のみをウォッシュアウト可能か検討する。
(III) 検出感度向上のためのSample Prep.法の検討
末端にメタクリル基を修飾した固定化プローブを用いて、HeLa細胞に一次プローブと補足プローブを添加した後にアクリルアミドゲルで包埋し、miRNAの固定化が可能かどうかを蛍光顕微鏡で評価していく。
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