新規分化誘導系による篩要素の選択的自己分解機構の解明

Research Project

Project/Area Number	23K19366
Research Category	Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	0702:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	杉山友希名古屋大学, 高等研究院(理), 特任助教 (60844769)
Project Period (FY)	2023-08-31 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000) Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	シロイヌナズナ / 篩要素 / オルガネラ / ライブイメージング
Outline of Research at the Start	篩管の構成単位である篩要素は、光合成産物等の輸送に適した構造と成るために細胞質やオルガネラ、細胞壁の一部までを失う。しかし、この劇的な変化の分子機構はほとんど明らかになっていない。その主な原因は、篩要素は細胞サイズが小さくかつ組織の深くに位置するために、明瞭なライブイメージングが困難なことにある。私は、VISUALと呼ばれる手法を独自に改良し、シロイヌナズナの胚軸に大きくて観察しやすい篩要素を形成させることに成功した。本研究では、この独自の分化誘導系の使用を本格化させ、篩要素における細胞質・オルガネラ分解の分子基盤を解明する。
Outline of Annual Research Achievements	篩管の構成単位である篩要素は、光合成産物の輸送能を獲得するために核やゴルジ装置などを選択的に失う。その分子機構はほとんど未知であるが、篩要素分化に必須の転写因子APLの欠損株においてオートファゴソームの形成に必須なATG8Aの発現量が低下していることなど、幾つかの証拠がオートファジーの関与を示唆している。 Single cell root atlasのデータによると、シロイヌナズナに9つあるATG8サブファミリーはいずれも分化後期の篩要素において発現している。それらの可視化ラインを入手し、篩要素における発現と局在を調べたところ、ATG8A, ATG8C, ATG8G, ATG8Iが特によくオートファジーとの関連を想起させる粒状の構造として観察されることが分かった。上記の顕著な発現変動も踏まえて、サブファミリーの中でもATG8Aを中心として解析を進めることにした。篩要素分化において消失することが知られるゴルジ装置とATG8Aの二重可視化ラインを作出し、根の篩要素における局在を観察したが、篩要素の細胞サイズの小ささゆえに明瞭なライブイメージングが困難であり、ゴルジ装置の消失とオートファジーの関連性をはっきりと見出すことはできなかった。細胞内構造の詳細な観察には大きくて観察しやすい篩要素を作らせることのできる分化誘導系が適していることから、当初の予定通り、世代を進めて安定したラインを確立した後に分化誘導系を用いて再解析することとした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 篩要素分化におけるオルガネラとオートファジー因子の動態を分化誘導系と組み合わせて詳細に観察する用意が整ったため。また、下記の生化学的な解析に向けたマテリアルの用意も進んだため。
Strategy for Future Research Activity	篩要素における選択的オートファジーのターゲット同定を目指して、ATG8をベイトとした共免疫沈降実験およびMS解析を行う。また、オートファジーの欠損による篩要素の分化や輸送能への影響を調べるためにオートファジー欠損株（atg2, atg5）を用いた蛍光色素の輸送アッセイなどを行う。